茶樹總蛋白質(zhì)提取方法及雙向電泳體系的建立

周瓊瓊等

摘 要 為探索適用于茶樹葉片蛋白質(zhì)組學(xué)研究的雙向電泳技術(shù)體系（2-DE），比較三氯乙酸（TCA）/丙酮沉淀法和改良酚抽法2種不同總蛋白質(zhì)提取方法、不同蛋白上樣量對2-DE的影響。結(jié)果表明：改良酚抽法更適合茶樹總蛋白質(zhì)的提??；采用1.5 mg的蛋白質(zhì)上樣量，最終可獲得蛋白質(zhì)點(diǎn)較多、背景清晰、分辨率較高的雙向電泳圖譜，為進(jìn)一步深入開展茶樹蛋白質(zhì)組學(xué)的研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 茶樹；葉片；蛋白質(zhì)組學(xué)；雙向電泳

中圖分類號 Q949.758.4 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Establishment of Extraction Methods and

Two-dimensional Electrophoresis Conditions

for Proteomic Analysis of Camellia sinensis

ZHOU Qiongqiong1，SUN Weijiang1，2*

1 College of Horticulture， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

2 Anxi Tea College， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

Abstract In order to develop efficient two-dimensional electrophoresis（2-DE） conditions suitable for tea proteome analysis， the effects of different protein extraction methods and sample loading amount were compared. The results showed that the modified phenol extraction protocol was more suitable for total protein extraction of tea compared with trichloroacetic acid（TCA）/acetone precipitation. And loading 1.5 mg protein sample， a high quality 2-DE image map with more protein spots， clear background and high protein point resolution was obtained. The research provides a foundation for further study of tea proteomics.

Key words Tea；Leaf；Proteomics；Two-dimensional electrophoresis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.08.012

蛋白質(zhì)組學(xué)現(xiàn)已成為后基因組學(xué)時代的研究熱點(diǎn)之一。蛋白質(zhì)是生物功能的主要執(zhí)行者和體現(xiàn)者，可更直接地揭示生命活動的本質(zhì)。通過蛋白質(zhì)組的分析可了解蛋白質(zhì)的表達(dá)水平、檢測生命活動變化過程中蛋白質(zhì)的表達(dá)量及翻譯后修飾等的變化，從而闡明生物功能產(chǎn)生的機(jī)制[1]。近年來，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)研究的各個方面。雙向電泳（Two dimensional electrophoresis，2DE）技術(shù)自1975年由OFarrell[2]提出，在細(xì)菌、動物組織、細(xì)胞及植物等全蛋白組分研究方面發(fā)揮了巨大作用，與質(zhì)譜技術(shù)、生物信息學(xué)稱為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的3大核心技術(shù)[3]。

根據(jù)已有的研究結(jié)果表明，不同的植物材料由于組織特異性和代謝產(chǎn)物的差異，其雙向電泳體系不盡相同，目前尚沒有一種適用于所有植物樣品的蛋白質(zhì)樣品制備方法和雙向電泳技術(shù)體系。曾廣娟等[4]探索了適用于蘋果葉片蛋白質(zhì)雙向電泳樣品的制備方法，最終得出Tris-HCl提取蛋白所得圖譜背景清晰、蛋白質(zhì)信息量大；趙芹等[5]采用改良酚抽法提取節(jié)瓜蛋白質(zhì)總量較高，采用17 cm、pH4～7范圍IPG膠條、120 μg蛋白質(zhì)上樣量、12%凝膠濃度，硝酸銀染色獲得蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)豐富、分辨率高、背景清晰且重復(fù)性好的雙向電泳圖譜；秦利征等[6]建立了適用于水稻根系蛋白質(zhì)組研究的改良TCA/丙酮/SDS法，且蛋白上樣量為350 μg時所獲得的雙向凝膠圖譜清晰、重現(xiàn)性好。由此可見，針對不同植物和組織選取合適的蛋白質(zhì)樣品制備方法及雙向電泳技術(shù)體系對于試驗(yàn)結(jié)果至關(guān)重要。

茶樹[Camellia sinensis（L.）O. Kuntze]屬山茶科山茶屬，為多年生常綠木本植物。茶樹葉片含有大量的多糖、多酚及色素等次生代謝產(chǎn)物，在研磨時，多酚類物質(zhì)極易發(fā)生氧化，影響蛋白樣品的制備及電泳過程[7]，這些因素給茶樹蛋白質(zhì)組學(xué)研究的開展增加了難度。本研究在前人研究結(jié)果的基礎(chǔ)上[7-10]，對茶樹蛋白質(zhì)提取方法、蛋白上樣量等因素進(jìn)行探討，旨在探索一種高質(zhì)量的茶樹葉片蛋白質(zhì)提取方法及雙向電泳技術(shù)體系，提高茶樹蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜的分辨率，為后續(xù)茶樹蛋白質(zhì)組學(xué)的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 2013年春于福建省武夷山市茶葉研究所采集茶樹一芽二葉（武夷奇種18號），液氮固樣，貯存于-80 ℃冰箱備用。

1.1.2 主要儀器與試劑 Ettan IPGphor等電聚焦儀、Ettan DALT six垂直電泳儀（美國GE Healthcare公司），透射掃描儀（EPSON Perfection 2480 Photo），高速冷凍離心機(jī)（美國Beckman公司），電泳儀、水平搖床（北京六一儀器廠），電子分析天平（德國Satorius公司），UV-Vis分光光度計(jì)（英國Biochrom公司），超低溫冰箱（青島海爾特種電器有限公司）。

四甲基乙二胺（TEMED）、β-巰基乙醇（β-Me）、硫脲（Thiourea）為Amersham Biosciences公司產(chǎn)品，礦物油、Triton X-100為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品，固相pH梯度線性預(yù)制IPG干膠條（24 cm，pH4～7）、載體兩性電解質(zhì)（Biolyte，pH4～7）購自美國GE公司，三羥甲基氨基甲烷（Tris）、兩性表面活性劑（CHAPS）、甘氨酸（glycerol）、30%丙烯酰胺/雙丙烯酰胺（29 ∶ 1）、低熔點(diǎn)瓊脂糖、尿素（Urea）、碘乙酰胺（IAA）、二硫蘇糖醇（Dithiothreitol，DTT）、十二烷基硫酸鈉（SDS）購自生工生物工程（上海）股份有限公司，蛋白Marker、過硫酸銨（APS）、牛血清蛋白（BSA）等為美國Sigma產(chǎn)品，考馬斯亮藍(lán)G-250（CBB G-250）、甘油、丙酮、甲醛、無水碳酸鈉、冰乙酸等為國產(chǎn)分析純試劑，所有溶液均用超純水配置。

1.2 方法

1.2.1 蛋白質(zhì)干粉的制備 （1）改良酚抽法：參照Saravanan等[11]的方法并稍作改進(jìn)。取1 g材料置液氮中充分研磨成粉末，加入4 mL預(yù)冷的酚抽提取液[100 mmol/L pH7.8 Tris-HCl，100 mmol/L KCl，50 mmol/L抗壞血酸，50 mmol/L硼砂，1%（V/V）Triton X-100，1%（V/V）β-Me]，待其融化后繼續(xù)研磨數(shù)分鐘，轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中；加入等體積的pH8.0 Tris-Phenol，渦旋震蕩，13 000 ×g，4 ℃離心15 min，轉(zhuǎn)移酚相至50 mL離心管中，加入5倍體積預(yù)冷的0.1 mol/L乙酸銨甲醇溶液，-20 ℃過夜沉淀；13 000 ×g，4 ℃離心15 min，棄上清液；將沉淀懸浮于預(yù)冷的甲醇溶液，-20 ℃靜置2 h，13 000 ×g，4 ℃離心15 min，棄上清液；用預(yù)冷的含0.1% β-Me丙酮溶液清洗，13 000 ×g，4 ℃離心15 min，棄上清液；重復(fù)上述操作2～3次，離心，收集沉淀；用80%丙酮清洗，離心，收集沉淀，-20 ℃冷凍干燥，所得干粉置-80 ℃保存待用。

（2）TCA/丙酮沉淀法：參照Dameral等[12]的方法并稍作改進(jìn)。取1 g材料置液氮中充分研磨成粉末，懸浮于10倍體積預(yù)冷的10% TCA/丙酮溶液，-20 ℃沉淀過夜，13 000 ×g，4 ℃離心15 min，棄上清，加入含0.07% DTT的丙酮清洗，13 000 ×g，4 ℃離心15 min，棄上清，重復(fù)丙酮沉淀直至上清無色，最后冷凍干燥-20 ℃保存。

1.2.2 蛋白裂解 稱取10 mg蛋白質(zhì)干粉于2 mL離心管中，加入300 μL樣品裂解液[8 mol/L尿素，2 mol/L硫脲、2%（W/V）CHAPS、2%（V/V）兩性電解質(zhì)載體Biolyte]，冰浴超聲波處理2 h，13 000 ×g，4 ℃離心15 min，取上清液用于蛋白質(zhì)定量和雙向電泳分析。

1.2.3 蛋白含量的測定 蛋白含量的測定參照Bradford等[13]的方法，以牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.2.4 雙向電泳分析 （1）第一向等電聚焦電泳（IEF）：采用Ettan IPGphor等電聚焦系統(tǒng)，24 cm、pH4～7 IPG預(yù)制干膠條。根據(jù)蛋白濃度測定結(jié)果，分別取含1.0、1.5 mg蛋白的樣品溶液加水化液[8 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%（W/V）CHAPS、0.5%（V/V）IPG buffer、13 mmol/L DTT、0.002%（W/V）溴酚藍(lán)]至總體積為450 μL。設(shè)置IEF程序，進(jìn)行第一向等電聚焦（表1）。

（2）膠條平衡：將等電聚焦完成后的IPG膠條分別用平衡液Ⅰ[50 mmol/L pH8.8 Tris-HCl、6 mol/L尿素、30%（V/V）甘油、2%（W/V）SDS、0.002%（W/V）溴酚藍(lán)、1%（W/V）DTT]、平衡液Ⅱ[50 mmol/L pH 8.8 Tris-HCl、6 mol/L尿素、30%（V/V）甘油、2%（W/V）SDS、0.002%（W/V）溴酚藍(lán)、2.5%（W/V）碘乙酰胺]平衡15、20 min，平衡后取出膠條，用濾紙吸去殘余平衡液，轉(zhuǎn)移至第二向SDS-PAGE凝膠上。

（3）第二向聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）：采用Ettan DALT six垂直電泳系統(tǒng)和灌膠模具。將平衡好的膠條轉(zhuǎn)移至12% SDS-PAGE凝膠上，用低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液[0.5%（w/V）瓊脂糖和0.002%（w/V）溴酚藍(lán)溶于SDS電泳緩沖液，40 ℃左右為宜]封膠，然后進(jìn)行凝膠配置（表2）。

14 ℃水循環(huán)條件下進(jìn)行電泳，恒壓運(yùn)行，起初低電壓80 V，1 h后待蛋白全部轉(zhuǎn)移至PAGE膠上后，加大電壓至250 V，待示蹤的溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠底部邊緣時停止電泳。

（4）考馬斯亮藍(lán)染色：電泳結(jié)束后迅速剝離凝膠，置于固定液（40%甲醇、10%乙酸，超純水配置）中固定30 min后，用超純水漂洗3次，每次15 min，然后將凝膠再置于染色液（0.05% G-250、50% 甲醇、10%乙酸，超純水配置），室溫?fù)u床染色過夜，超純水清洗至背景變淺、蛋白點(diǎn)清晰可見為止。

（5）凝膠掃描及分析：采用EPSON Perfection 2480 Photo透射掃描儀對脫色后的凝膠進(jìn)行圖像掃描，光學(xué)分辨率設(shè)為300 dpi（dot per inch），對比度與亮度采用軟件默認(rèn)值。圖像分析采用PDQuest軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蛋白質(zhì)提取方法對2-DE圖譜的影響

蛋白質(zhì)樣品的制備是進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究的基礎(chǔ)和前提，是雙向電泳能否成功的關(guān)鍵，直接影響圖譜的質(zhì)量和試驗(yàn)結(jié)果的可靠性、重復(fù)性。本試驗(yàn)分別對TCA/丙酮沉淀法和酚抽法提取蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行2-DE分離和染色，結(jié)果見圖1。

TCA/丙酮沉淀法獲得的蛋白質(zhì)含量最少，裂解液溶解時不易分散，測得的蛋白濃度為12 μg/μL；酚抽法所得的蛋白質(zhì)沉淀較多，易溶解，蛋白濃度為20 μg/μL。經(jīng)PDQuest軟件統(tǒng)計(jì)分析，在相同條件下進(jìn)行雙向電泳，TCA/丙酮沉淀法提取獲得約600個蛋白點(diǎn)，蛋白點(diǎn)較少，圖譜背景橫紋較多且含有豎條紋；TCA/丙酮沉淀法雖操作簡單，耗時短，但提取蛋白時受到酚類和多糖類等物質(zhì)的干擾，蛋白質(zhì)丟失現(xiàn)象嚴(yán)重，得到的蛋白粉末再溶解性較差，很難重新溶解[14]，影響了蛋白質(zhì)的聚焦；改良酚抽法提取獲得約1 300多個蛋白點(diǎn)，數(shù)量較多，雖操作相對繁復(fù)，但蛋白完整性高，純度高，再溶解性好，所得圖譜背景清晰、蛋白點(diǎn)分布均勻，橫縱條紋及彌散狀的蛋白質(zhì)點(diǎn)較少，質(zhì)量最佳。由此可見，改良酚抽法比較適合茶樹葉片蛋白的提取，雙向電泳分離效果好。

2.2 不同上樣量對2-DE圖譜的影響

蛋白質(zhì)的上樣量直接影響電泳圖譜的質(zhì)量，過高或過低都不能達(dá)到最佳的分離效果。本試驗(yàn)設(shè)2個水平上樣量1.0、1.5 mg，對其進(jìn)行雙向電泳。由圖2可知，上樣量為1.0 mg時，蛋白點(diǎn)能較好的分開，但低分子量蛋白區(qū)域點(diǎn)缺失較多、低豐度蛋白較少，背景不夠清晰，有橫豎條紋，蛋白點(diǎn)有拖尾現(xiàn)象；上樣量為1.5 mg時，蛋白檢出率增高，蛋白點(diǎn)分布均勻，無擴(kuò)散和拖尾現(xiàn)象，背景清晰?？梢姡鞍咨蠘恿繛?.5 mg時，所得圖譜質(zhì)量較好。

3 討論與結(jié)論

3.1 樣品制備

樣品制備的好壞直接決定雙向電泳圖譜的分辨率、重復(fù)性、穩(wěn)定性和分離效果。TCA/丙酮法和酚抽提法是2種最常用的蛋白質(zhì)提取方法。茶樹蛋白質(zhì)組學(xué)研究開展的較晚，成果較少。林金科等[7]較早將改良后的TCA/丙酮法應(yīng)用于茶樹蛋白質(zhì)組的樣品制備，電泳圖譜分辨出500個蛋白點(diǎn)，所得的蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)較少；李勤等[8]應(yīng)用改良的Tris-HCl抽提法提取茶樹總蛋白；任燕等[15]應(yīng)用TCA/丙酮-clean up kit法提取茶樹雌蕊總蛋白，獲得清晰、分辨率高、重復(fù)性好的雙向電泳圖譜，共檢測到約1 200個蛋白點(diǎn)。而酚抽法在茶葉蛋白的研究方面應(yīng)用較少，但在果實(shí)蛋白質(zhì)提取過程中應(yīng)用較多（如桃、柑橘、蘋果、葡萄等）[16]。本研究比較了TCA/丙酮法和改良酚抽法提取茶葉總蛋白的雙向電泳結(jié)果，根據(jù)茶葉富含多糖多酚等次生代謝物質(zhì)的特點(diǎn)，改良的酚抽法中乙酸銨甲醇沉淀過后又用預(yù)冷的含0.1%β-Me的丙酮溶液和80%的丙酮溶液分別再次清洗沉淀，用來破壞蛋白表面的水化膜，降低蛋白質(zhì)水溶液的介電常數(shù)，從而達(dá)到沉淀蛋白的目的，提高蛋白得率，因此利用改良酚抽法提取茶樹蛋白質(zhì)，純度高，再溶解性好，所得圖譜背景清晰、蛋白點(diǎn)分布均勻，橫縱條紋及彌散狀的蛋白質(zhì)點(diǎn)較少，適合茶樹總蛋白質(zhì)的提取。TCA/丙酮法可有效的沉淀蛋白質(zhì)[12]，但不能徹底清除茶樹中一些酚類、醛類等次生代謝物質(zhì)及鹽離子，致使蛋白圖譜產(chǎn)生縱橫條紋，達(dá)不到理想的分離效果[17]，此外，該方法所得的蛋白樣品較難溶解[14]，造成蛋白點(diǎn)的丟失。這與李勤等[8]的研究結(jié)論相一致。

3.2 上樣量選擇

蛋白樣品的上樣量是影響雙向電泳圖譜的另一因素。上樣量過低會導(dǎo)致一些低豐度蛋白在圖譜上無法顯現(xiàn)或不清晰，檢測不到；上樣量過大，聚焦時電壓升的慢甚至不能達(dá)到所設(shè)定的電壓，從而影響等電聚焦的效果，蛋白質(zhì)點(diǎn)重疊、串聯(lián)，在高相對分子質(zhì)量的區(qū)域蛋白質(zhì)展現(xiàn)不好，產(chǎn)生橫向條紋，影響蛋白質(zhì)的分離[18-19]。雙向電泳最佳上樣量受多種因素影響，需根據(jù)樣品特性、IPG膠條長度和pH范圍、聚焦時間、染色方法等，選用適當(dāng)?shù)牡鞍咨蠘恿?，提高雙向電泳圖像的質(zhì)量。本研究在IPG預(yù)制膠條規(guī)格為24 cm、pH4～7的條件下，采用2個上樣量進(jìn)行雙向凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)上樣量1.5 mg時，2-DE圖譜蛋白質(zhì)分離效果好、蛋白點(diǎn)數(shù)目多。

3.3 超聲處理

本研究在裂解茶樹蛋白干粉時，為了得到高質(zhì)量的雙向電泳圖譜，采用冰浴超聲法處理促進(jìn)了蛋白沉淀的溶解。這與徐幼平等[1]的研究結(jié)果相一致。添加冰塊可防止超聲過程中水浴溫度的上升，造成蛋白裂解液中的尿素變性，以免影響后續(xù)的第一向電泳。超聲處理時強(qiáng)度和時間不宜過大、過長，以免導(dǎo)致蛋白降解。

綜上所述，采用改良酚抽法更適合茶樹總蛋白質(zhì)的提取，結(jié)合超聲助溶的方法、1.5 mg的蛋白質(zhì)上樣量，最終可獲得蛋白質(zhì)點(diǎn)較多、背景清晰、分辨率較高的雙向電泳圖譜，可滿足茶樹蛋白質(zhì)組學(xué)的分析和研究，為進(jìn)一步深入開展茶樹差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究工作奠定了基礎(chǔ)。

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責(zé)任編輯：黃東杰