2種保存方法對五唇蘭基因組DNA提取質(zhì)量的影響

胡翔宇等

摘 要 采用改良CTAB法研究經(jīng)硅膠干燥法和保鮮法保存的五唇蘭葉片DNA降解規(guī)律，并比較兩種保存方法葉片DNA的保存時間，為葉片的野外遠(yuǎn)距離采集提供指導(dǎo)。結(jié)果顯示，采取硅膠干燥法進(jìn)行保存的五唇蘭葉片DNA和SOD以及POD的含量下降迅速，第1天DNA的產(chǎn)率已經(jīng)下降到65.4 ng/g，ISSR引物可以檢測出7條清晰的條帶，第2天DNA則降解完全，SOD和POD含量2 d內(nèi)快速較少，第2天分別降到68%和27%；采取葉片保鮮法保存的五唇蘭葉片DNA一周內(nèi)保存完好，產(chǎn)率較高，為71 ng/g左右，ISSR引物可以檢測出7條清晰的條帶，7 d之后DNA開始降解，ISSR引物擴(kuò)增出的條帶變得模糊，隨著葉片衰老進(jìn)程的加劇以及葉片開始出現(xiàn)腐爛等性狀，DNA降解逐漸加速，第13天降解完全，SOD和POD含量的變化呈現(xiàn)出與DNA產(chǎn)率一致的趨勢，先上升后下降，在第9天達(dá)到峰值。葉片DNA的降解規(guī)律和衰老規(guī)律呈現(xiàn)出一致性，離體五唇蘭葉片DNA降解主要原因來自于葉片衰老的加劇以及期間產(chǎn)生的有毒物質(zhì)的積累，野外遠(yuǎn)距離采集五唇蘭葉片可采用保鮮法保存以防止DNA的快速降解。

關(guān)鍵詞 蝴蝶蘭；遠(yuǎn)距離采樣；葉片衰老；DNA降解

中圖分類號 S682.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

Effects of Two Sample Preserving Methods on Genomic

DNA Extraction Quality of Phalaenopsis

pulcherrima（Orchidaceae）

HU Xiangyu1，2， DING Qiong2， SONG Xiqiang1，2 *

WANG Jian2， ZHONG Yunfang1，3

1 Key Laboratory of Protection and Developmental Utilization of Tropical Crop Germplasm Resources（Hainan University），

Ministry of Education， Haikou， Hainan 570228， China

2 College of Horticulture and Landscape Architecture， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

3 Hainan Evergreen Landscape Technology Limited Company， Haikou， Hainan 570010， China

Abstract A modified CTAB method was used to research the DNA degradation rule of P. pulcherrima leaves saved with silica gel and the low temperature fresh-keeping method respectively. The results showed that DNA degradation of leaves saved with silica gel was rapid， the DNA production rate after one day dropped to 65.4 ng/g， seven clear bands were detected using ISSR primers， and DNA degraded completely after two days； However， DNA of P. pulcherrima leaves saved with low temperature fresh-keeping method could be preserved for one week， and the yield was higher， about 71 ng/g， ISSR primers could detect seven clear bands， after 7 days DNA began to degrade and PCR bands became blurry The rule of DNA degradation and senescence showed consistency. The main reasons for degradation of leaf DNA were intensification of senescence and the accumulation of toxic substances produced during the period. Leaves of P. pulcherrima sampled in the wild can take the method of low temperature to keep fresh.

Key words Phalaenopsis； Long-distance sampling； Leaf senescence； DNA degradation

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.08.017

DNA的提取與純化是進(jìn)行分子標(biāo)記試驗(yàn)最關(guān)鍵的一步，獲得高質(zhì)量的DNA樣品是進(jìn)行PCR擴(kuò)增的前提[1]。葉片采集之后，離體葉片由于受到內(nèi)外因素的限制，不可避免地產(chǎn)生衰老。Nodden概括了以往葉片衰老研究結(jié)果后提出葉片衰老的中心途徑可分為3個時期。誘導(dǎo)期：內(nèi)外因素導(dǎo)致了葉片衰老的形成，如激素、糖類、水分、溫度等；重組期：大分子如蛋白質(zhì)和脂類開始降解；終止期：葉片衰老的最后時期，細(xì)胞自溶反應(yīng)，核酸如DNA開始降解[2]。

因此，若采集材料后不能馬上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，那么就要選取合適的保存方法以延緩葉片的衰老，防止DNA的降解。Doyle 和Dickson[3]曾用解剖學(xué)上常用的化學(xué)試劑來保存植物材料，但獲得DNA均被嚴(yán)重降解，Chase和Hills[4]用硅膠快速干燥法保存金虎尾科（Malpighiacae）等植物葉片，獲得DNA與新鮮葉片相似。遠(yuǎn)距離采樣一般無法對新鮮材料立刻提取DNA，干燥的植物樣本可以用硅膠浸潤，并用塑料袋密封，如果樣本干燥不徹底，那么DNA很可能在短時間內(nèi)降解；采用液氮或干冰低溫保存材料，則攜帶運(yùn)輸不便，不安全，費(fèi)用也高，一些特殊的材料，比如新生的嫩芽可以在4 ℃存放幾天，比較大的組織如樹枝可以用濕布包裹，外面套一層塑料，防止脫水[5]。

五唇蘭（Phalaenopsis pulcherrima），蘭科蝴蝶蘭屬，東亞特有種，我國僅海南昌江、樂東等地有分布。生于密林或灌叢中，常見于覆有土層的巖石上[6]。五唇蘭葉片肉質(zhì)或厚肉質(zhì)，采集之后如不采取特殊的保存措施，葉片容易快速的衰老和腐爛，對DNA的提取造成較大的影響。本研究使用改良CTAB法比較了離體葉片分別在硅膠干燥和葉片保鮮保存后DNA的提取質(zhì)量及其降解規(guī)律，擬探究以下問題：（1）兩種方法保存的五唇蘭葉片衰老的規(guī)律；（2）兩種方法保存的五唇蘭葉片DNA降解規(guī)律；（3）葉片衰老和葉片DNA降解之間的關(guān)系；（4）五唇蘭DNA野外遠(yuǎn)距離的采樣策略。

1 材料與方法

1.1 材料的采集與處理

五唇蘭葉片采自海南大學(xué)園藝園林學(xué)院教學(xué)實(shí)踐基地，采集生長良好、無病菌的葉片。設(shè)置兩種處理：（1）采集的五唇蘭葉片剪成小塊（約長6 mm×寬6 mm）立即放入盛有硅膠的封口袋中干燥，硅膠變色后立即更換新硅膠；（2）采集的葉片放入盛有干冰的泡沫盒中，帶回實(shí)驗(yàn)室放入0 ℃冰箱內(nèi)。

1.2 方法

1.2.1 五唇蘭葉片DNA的提取以及質(zhì)量的檢測

分別于第0、1、2、3、5、7、9、11、13天，采用CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）法[7]提取五唇蘭葉片基因組DNA，并用瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計測定基因組DNA的質(zhì)量和濃度。DNA濃度（ng）=A260×50×稀釋倍數(shù)×原液體積/1 000；DNA產(chǎn)率（ng/g）=DNA濃度（ng）/葉片質(zhì)量（g）。

1.2.2 ISSR-PCR電泳檢測五唇蘭葉片的DNA質(zhì)量 使用哥倫比亞大學(xué)公布的100套引物中的引物827電泳檢測五唇蘭葉片DNA提取質(zhì)量，反應(yīng)體系為在20 μL的反應(yīng)體系中，Taq DNA聚合酶1.0 U，Mg2+ 1.5 mmol/L，dNTP 1.80 mmol/L，引物0.5 μmol/L，DNA為30 ng。

1.2.3 五唇蘭葉片SOD、POD含量的測定 SOD（Superoxide Dismutase， 即超氧化物歧化酶）含量的測定參考Spychalla和Desborough[8]的方法，POD（Peroxidase， 即過氧化物酶）的含量測定參考Polle等[9]的方法。五唇蘭葉片鮮樣分別在第1、2、3、5、7、9、11、13天測定SOD和POD的活性，五唇蘭干樣葉片在第1、2天測定SOD和POD的活性。

1.2.4 五唇蘭葉片含水量的測定 采用干燥法測定五唇蘭葉片含水量，首先測定葉片鮮重M1，將葉片放置于烘箱中，105 ℃干燥4 h至恒重，測定葉片干重M2，葉片含水量為（M1-M2）/M1。

2 結(jié)果與分析

2.1 2種保存方法五唇蘭葉片DNA的降解規(guī)律

2.1.1 2種保存方法五唇蘭葉片DNA質(zhì)量的變化

低溫鮮樣保存的五唇蘭葉片，保存7 d，質(zhì)量良好，提取的DNA電泳條帶清晰、明亮。第7天后DNA開始逐漸降解，至第13天降解完全，此時無電泳條帶（圖1-a～e）；而采用硅膠干燥保存的五唇蘭葉片，第2天DNA降解完全（圖1-f～g）。

2.2 2種保存方法五唇蘭葉片DNA產(chǎn)率的變化

低溫鮮樣保存法的五唇蘭葉片在前7 d DNA的提取產(chǎn)率基本上無變化，維持在71%左右，從第7天開始葉片DNA產(chǎn)率急劇下降，第13天DNA產(chǎn)率為0，DNA分解完全；而硅膠干燥保存的五唇蘭葉片則在第1天DNA產(chǎn)率就已經(jīng)下降到65.4 ng/g，第2天DNA產(chǎn)率為0，此時DNA分解完全（表1）。

2.3 2種方法保存五唇蘭葉片DNA PCR擴(kuò)增結(jié)果的變化

采取低溫鮮樣保存法的五唇蘭葉片前7天PCR擴(kuò)增效果較好，擴(kuò)增出了7條清晰的條帶，而第9天擴(kuò)增的條帶較為模糊，條帶數(shù)量也減少到5條（圖2-a、b），因此采取低溫鮮樣保存法的五唇蘭葉片適宜在一周內(nèi)提取DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增；而采取硅膠干燥保存法的五唇蘭葉片在第1天可以擴(kuò)增出7條清晰的條帶，但第2天則無法擴(kuò)增出條帶（圖2-c）。

2.4 2種保存方法五唇蘭葉片的衰老規(guī)律

2.4.1 2種保存方法五唇蘭葉片SOD和POD含量的變化 采用低溫鮮樣保存法的五唇蘭葉片SOD和POD的含量都呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，峰值出現(xiàn)在第9天，之后由于葉片開始出現(xiàn)腐爛現(xiàn)象，SOD和POD的含量開始下降（圖3）；而采取干燥保存法的五唇蘭葉片SOD和POD的含量則在2 d內(nèi)急劇下降，第2天SOD和POD的含量已經(jīng)下降到很低（圖4）。

2.5 2種保存方法五唇蘭葉片含水量的變化

采用低溫鮮樣保存法的五唇蘭葉片含水量在13 d之內(nèi)呈現(xiàn)穩(wěn)定的趨勢，維持在90%～95%之間，13 d之內(nèi)的含水量無明顯差異（p>0.05）；而采取干燥保存法的葉片含水量兩天內(nèi)雖然有所下降，但是含水量仍在80%以上（圖5）。

3 討論與結(jié)論

3.1 采取鮮樣保存法的五唇蘭葉片衰老和DNA降解之間的關(guān)系

超氧物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）等可清除活性氧自由基，從而防止自由基的毒害，稱其為保護(hù)酶系統(tǒng)[10]。正常情況下SOD、POD活性相對穩(wěn)定，而在衰老過程中SOD、POD活性逐漸升高，清除植物體內(nèi)過量的活性氧，保護(hù)膜結(jié)構(gòu)，從而能在一定程度上延緩植物器官的衰老過程[11]。

葉片衰老的誘導(dǎo)和重組階段，一些大分子如蛋白質(zhì)、脂類產(chǎn)生降解，但DNA不被分解[12]，在葉片衰老的終止階段，細(xì)胞開始產(chǎn)生自溶性反應(yīng)，可以檢測到例如染色質(zhì)濃縮以及DNA片段化等細(xì)胞凋亡的顯著特征[13-14]。本研究第8～13天，采取低溫鮮樣保存的五唇蘭葉片屬于葉片衰老的終止階段，在此階段葉片開始腐爛，DNA產(chǎn)率快速減少（p<0.05），SOD和POD含量開始有略微的增高（第8～9天），之后急劇下降，研究結(jié)果與朱誠等[12]以及Wollaston等[15]的研究結(jié)果一致，因此低溫鮮樣保存法使五唇蘭葉片保存一周而DNA不被降解。

3.2 采取硅膠干燥保存法的五唇蘭葉片衰老和DNA降解之間的關(guān)系

環(huán)境濕度的降低能夠明顯的促進(jìn)DNA的降解[16]，環(huán)境濕度最終通過影響葉片含水量而間接影響葉片DNA的降解。

現(xiàn)階段，為了使葉片DNA不被降解，硅膠快速干燥保存已經(jīng)成為一種非常有用的葉片方法，前人已經(jīng)使用硅膠干燥葉片來保存葉片并獲得了良好的研究結(jié)果[17-19]。然而，五唇蘭葉片肉質(zhì)，硅膠無法對葉片進(jìn)行快速干燥，采取硅膠干燥保存方法的五唇蘭葉片第2天仍具有很高的含水量（81.2%），五唇蘭葉片含水量的降低對葉片本身形成了干旱脅迫，加快了葉片衰老的進(jìn)程，葉片衰老在兩天之內(nèi)快速完成，期間SOD和POD活性快速降低，DNA急劇降解。

3.3 五唇蘭葉片野外采集之后的保存

野外采集葉片時由于采取真空法以及液氮保存法較為困難，因此對于較薄且水分容易散失的葉片，一般采取硅膠快速干燥法進(jìn)行保存，既經(jīng)濟(jì)又方便。然而五唇蘭葉片含水量較高，且葉片表面角質(zhì)層較厚，因此采取硅膠干燥法無法快速的去除葉片的水分，從而形成干旱脅迫，加劇了衰老的進(jìn)程，促進(jìn)DNA的快速降解。因此對于五唇蘭這種肉質(zhì)葉片以及葉片角質(zhì)層較厚從而無法使水分快速散失的植物，采取保鮮的方法對植物的葉片進(jìn)行保鮮保存是一種非常簡便又經(jīng)濟(jì)的方法，比如將葉片放入盛有干冰的冰盒以及如有條件可以放入0 ℃或者4 ℃冰箱等可保存7 d。

致 謝 海南大學(xué)園藝園林學(xué)院蒙真鋮和武華周同學(xué)參與了部分工作，特致謝忱！

參考文獻(xiàn)

[1] 劉塔斯， 林麗美， 龔力民， 等. 分子標(biāo)記中植物DNA提取方法的研究進(jìn)展[J]. 中南藥學(xué)， 2005， 3（6）： 370-373.

[2] Noodén L D， Guiamét J J， John I. Senescence mechanisms[J]. Physiologia Plantarum， 1997， 101： 746-753.

[3] Doyle J J， Dickson E E. Preservation of plant samples for DNA restriction endonuclease analysis[J]. Taxon， 1987， 36： 715-722.

[4] Chase H W， Hills H H. Silica gel： an ideal material for field preservation of leaf samples for DNA studies[J]. Taxon， 1991， 40： 215-220.

[5] Milligan B G， Hoelzel A R. Plant DNA isolation In Molecular genetic analysis of populations[M]. Oxofrd： Oxofrd University Press， 1992： 143.

[6] 柯海麗， 宋希強(qiáng)， 譚志瓊， 等. 野生五唇蘭根部內(nèi)生真菌多樣性研究[J]. 生物多樣性， 2007， 15： 456-462.

[7] Untergasser A. DNA Miniprep using CTAB[OL]. Untergassers Lab， http：//www.molbi.de/protocols/miniprep_dna_ctab_v1_0.htm， 2008.

[8] Spychalla J P， Desborough S L. Superoxide dismutase， catalase， and alpha-tocopherol content of stored potato tubers[J]. Plant Physiology， 1990， 94： 1 214-1 218.

[9] Foyer C H， Mullineaux P M. Causes of Photooxidative Stress and Amelioration of Defense Systems in Plants[M]. CRC press， 1994： 199-218.

[10] Beers R F J， Sizer I W. A spectrophotometric method for measuring the breakdown of hydrogen peroxide by catalase[J]. Journal of Biological Chemistry， 1952， 195（1）： 133-140.

[11] McCord J M， Fridovich I. Superoxide dismutase： an enzymic function for erythrocuprein（hemocuprein）[J]. Journal of Biological Chemistry， 1969， 244（22）： 6 049-6 055.

[12] 朱 誠， 曾廣文. 桂花花衰老過程中的某些生理生化變化[J]. 園藝學(xué)報， 2000， 27（5）： 356-360.

[13] Delorme V G， McCabe P F， Kim D J， et al. A matrix metalloproteinase gene is expressed at the boundary of senescence and programmed cell death in cucumber[J]. Plant Physiology， 2000， 123： 917-927.

[14] Simeonova E， Charzynska M， Mostowska A， et al. Aspects of programmed cell death during leaf senescence of mono-and dicotyledonous plants[J]. Protoplasma， 2000， 214： 93-101.

[15] Wollaston V B， Earl S， Harrison E， et al. The molecular analysis of leaf senescence a genomics approach[J]. Pant Biotechnol J， 2003， 1（1）： 3-22.

[16] 李春香， 楊 群. 模擬沉積環(huán)境下的溫度、濕度對葉片DNA降解的影響[J]. 生命科學(xué)研究， 2003， 7（3）： 250-254.

[17] 劉國彬， 龔榜初， 羅正榮. 錐栗葉樣保存時間對DNA提取質(zhì)量的影響[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2009（4）： 8-10

[18] 田永航， 羅洪發(fā). 水稻干燥組織DNA模板的快速制備[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報， 2010， 26（11）： 32-35.

[19] 焦培培， 王彥芹， 龐新安， 等. 瀕危物種胡楊和灰葉胡楊總DNA提取及RAPD體系優(yōu)化[J]. 植物研究， 2012， 32（3）： 320-325.

責(zé)任編輯：沈德發(fā)