海南龍血樹查爾酮合酶基因（DcCHS）的克隆及表達(dá)分析

王佳媛等

摘 要 利用RT-PCR和RACE技術(shù)對海南龍血樹查爾酮合酶基因進行克隆，得到1條1 456 bp的cDNA序列，命名為DcCHS。DcCHS含有1 173 bp的閱讀框架、99 bp的5′非編碼區(qū)和184 bp的3′非編碼區(qū)，編碼390個氨基酸。DcCHS與其他植物的CHS氨基酸序列同源性高達(dá)84%以上，具有高度保守的CHS_like結(jié)構(gòu)域、活性位點以及信號序列。推測DcCHS的分子量為42.7 ku，等電點pI為6.14，穩(wěn)定性極差，具有15個磷酸化位點，無跨膜結(jié)構(gòu)，無信號肽，亞細(xì)胞定位在細(xì)胞質(zhì)的可能性較大，并預(yù)測了蛋白質(zhì)的二級、三級結(jié)構(gòu)。組織特異性分析結(jié)果表明，DcCHS在花中的表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于根、莖、葉和果實。

關(guān)鍵詞 海南龍血樹；查爾酮合酶；克??；表達(dá)

中圖分類號 Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Cloning and Expression Analysis of Chalcone Synthase Gene

（DcCHS）in Dracaena cambodiana Pierre ex Gagnep

WANG Jiayuan1，2， DAI Haofu2， LI Huiliang2， GUO Dong2， PENG Shiqing2 *， MEI Wenli2 *

1 College of Agronomy， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

2 Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops， Ministry of Agriculture / Institute of Tropical Bioscience

and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract The full-length cDNA encoding chalcone synthase， designated as DcCHS， was isolated from Dracaena cambodiana by the RACE method. DcCHS contained a 1 173 bp open reading frame with 99 bp 5'UTR and 184 bp 3'UTR. The deduced DcCHS protein consisted of 390 amino acid residues with a calculated molecular weight of 42.7 ku and isoelectric point（pI）of 6.14. The deduced DcCHS， which shared more than 84% identities with the CHS protein from other plants， was predicted to possess the conserved CHS_like domain， active sites and signal sequences. DcCHS expressed at different levels with the highest transcription in the flowers， and the lowest transcription occurring in stems. The present study perhaps contributes towards an understanding of the characteristics in expression mechanism of DcCHS.

Key words Dracaena cambodiana； Chalcone synthase； Clone； Expression

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.08.016

海南龍血樹（Dracaena cambodiana Pierre ex Gagnep.），又稱小花龍血樹，龍舌蘭科龍血樹屬植物。國內(nèi)主要分布在海南的三亞、陵水、萬寧等地，國外在越南、柬埔寨也有分布。海南龍血樹是傳統(tǒng)名貴中藥血竭的一種基源植物[1]，血竭具有抗炎、止痛、止血、抗菌、抗腫瘤等多種藥理活性[1-3]。血竭的化學(xué)成分主要包括黃酮類化合物和皂苷類化合物[4]。其中，黃酮類化合物主要有黃酮、二氫黃酮、異黃酮、黃烷、異黃烷、高異黃烷、查爾酮、二氫查耳酮等，是血竭藥理活性成分的主要來源[5]。目前，國內(nèi)外關(guān)于血竭的研究主要集中在化學(xué)成分及藥理活性方面[6]，對其血竭形成的分子機理還不清楚。

為了研究血竭形成的分子機制，蔡文偉等[7]利用抑制消減雜交技術(shù)從龍血樹中分離得到51條可能與血竭生物合成相關(guān)的基因片段，但還未見這些基因的功能鑒定的進一步報道；張浩等[8]克隆了龍血樹的鈣依賴型蛋白激酶（CDPK）基因DCDPK2，可能與血竭合成的調(diào)控相關(guān)；Wang等[9]克隆了苯丙氨酸解氨酶（PAL）基因DcPAL1，證實了DcPAL1參與血竭合成過程。

查爾酮合酶（chalcone synthase，CHS）是黃酮類合成的第一個關(guān)鍵酶[10]，催化香豆酰輔酶A和丙二酰輔酶A生成苯基苯乙烯酮，這一過程為黃酮類物質(zhì)提供了基本的碳骨架。自1983年首次在歐芹中克隆CHS以來[11]，一些植物中的CHS相繼被克隆[12-17]。在高等植物中CHS以基因家族的形式存在。從結(jié)構(gòu)上看，多數(shù)CHS包含1個內(nèi)含子和2個外顯子，且內(nèi)含子的位置大致相同[18]。研究結(jié)果表明，植物中的CHS不同成員在發(fā)育、組織特異性及抗脅迫調(diào)控中起到不同作用[19-20]。筆者在GenBank中發(fā)現(xiàn)1條698 bp的龍血樹CHS序列（GenBank： JN377586），但該序列沒有完整的閱讀框架以及3′和5′序列。Blastx比對表明該片段編碼氨基酸序列與其他植物的CHS相對應(yīng)區(qū)域的同源性高達(dá)90%以上，表明該片段是龍血樹CHS片段。本研究根據(jù)該序列設(shè)計引物，通過RT-PCR和RACE技術(shù)克隆其全長cDNA，并對其進行了生物信息學(xué)和組織表達(dá)特異性分析，以期為進一步探討海南龍血樹中黃酮類次生代謝調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 多年生龍血樹種植在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所。龍血樹根、莖、葉、花、果實采集后用于組織特異性表達(dá)分析。

1.1.2 質(zhì)粒、試劑與菌株 克隆載體pMD19-T、Taq DNA聚合酶、T4-DNA連接酶、IPTG和X-gal購自TaKaRa公司；FastStart Universal SYBR Green Master購自Rox公司；RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit購自Thermo公司；SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit購自Clontech公司；DNA回收試劑盒購自Qiagen公司；普通質(zhì)粒小提試劑盒購自Real-Times公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純；E. coli DH10B由本實驗室保存；引物合成、DNA測序由北京諾賽生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成。

1.2 方法

1.2.1 海南龍血樹總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成 取海南龍血樹不同的組織，在液氮中研磨，參照文獻(xiàn)[21]進行總RNA的提取。cDNA第一鏈的合成按照RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit說明書進行。

1.2.2 海南龍血樹CHS保守序列的克隆 根據(jù)NCBI中已登錄的海南龍血樹CHS部分序列（GenBank： JN377586.1），設(shè)計特異引物F1（5′-TCGATGATCAA

GAAGCGATACATG-3′）和R1（5'-CAGTCCGAGATTC

CCAACGGCTT-3′）。以海南龍血樹總RNA的反轉(zhuǎn)cDNA作為模板，按照下列體系對CHS進行擴增：在0.2 mL離心管中加入10×PCR buffer 2 μL、2.5 mmol/L dNTP 2 μL、Taq DNA聚合酶0.5 μL、引物各1 μL、cDNA 1 μL，加ddH2O至總體積為20 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；然后94 ℃ 20 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，進行40個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，切膠回收。將回收的PCR產(chǎn)物與pMD19-T連接，轉(zhuǎn)化到DH10B菌株，在氨芐抗性平板上進行藍(lán)白斑篩選，再經(jīng)PCR檢測后送北京諾賽生物技術(shù)有限責(zé)任公司測序。

1.2.3 RACE技術(shù)擴增3′端和5′端 根據(jù)獲得的CHS部分序列設(shè)計3′RACE和5′RACE引物（表1）。cDNA的合成以及3′RACE和5′RACE的擴增按照SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit說明書進行操作。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收、克隆和鑒定后送北京諾賽生物技術(shù)有限責(zé)任公司測序。

1.2.4 海南龍血樹全長CHS的克隆 根據(jù)獲得的DcCHS序列的拼接結(jié)果，設(shè)計引物DcCHSF（5′- ATGGTGGCCATCGATGAGATCCGCAG-3′）和DcCHSR（5′-GTTAGTAGCCACACTGCGCAGCACG-3′）。擴增條件同1.2.2，PCR產(chǎn)物經(jīng)回收、克隆和鑒定后送北京諾賽生物技術(shù)有限責(zé)任公司測序。

1.2.5 DcCHS生物信息學(xué)分析 通過NCBI上的BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）對全長cDNA序列進行序列比對分析及開放性閱讀框（ORF）的預(yù)測；利用DNAMAN軟件進行同源物種分析；利用MEGA5.1進行系統(tǒng)進化樹分析；通過NCBI上的CDD（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）和Inter-ProScan（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/）進行功能結(jié)構(gòu)域和功能位點預(yù)測[22]；利用ExPASy服務(wù)系統(tǒng)中的ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測分析蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)[23]；利用NetPhos2.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）進行磷酸化位點分析[24]；利用TMHMM Seiwerv.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）進行蛋白跨膜區(qū)分析[24]；利用SignalP4.1 Server預(yù)測信號肽[24]；利用WoLF PSORT（http：//wolfpsort.seq.cbrc.jp/）在線軟件對該基因進行亞細(xì)胞定位[25]；利用LOOPP（http：//clsb.ices.utexas.edu/loopp/web/）預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)[26]；利用SWISS-MODEL（http：//www.expasy.ch/swissmod/SWISS-MODEL.html）分析蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)[27]。

1.2.6 DcCHS的組織特異性表達(dá)分析 根據(jù)獲得的DcCHS序列設(shè)計實時熒光定量引物DcCHSQF（5′-GAGTCGATCCGGGGACTTGG-3′）和DcCHSQR（5′- GACACATGTTATAGAACCCAATTTCAACAGA

T-3′）。以本課題組已克隆的海南龍血樹actin為內(nèi)參基因設(shè)計引物DcACTQF（5′-ACCGAGAGAGGGTA

CTCATT-3′）和DcACTQR（5′-CCAGCTCCTGCTCGTA

ATC-3′）。實時熒光定量PCR在Stratagene Mx3005P熒光定量PCR儀上進行，反應(yīng)體系按照FastStart Universal SYBR Green Master試劑盒說明書進行。PCR擴增條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 20 s，進行50個循環(huán)?；虮磉_(dá)量由熒光定量PCR自帶軟件MxPro QPCR Software分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DcCHS的克隆

總RNA經(jīng)測定OD260/OD280為2.09，OD260/OD230為1.92，表明RNA純度較高。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，RNA條帶清晰，完整性較好（圖1）。

通過PCR、3′和5′RACE擴增分別獲得了698 bp的中間片段、532 bp的3′端片段和367 bp的5′端片段（圖2-A、B、C）。將獲得的3個片段進行拼接獲得1456 bp的序列，拼接序列命名為DcCHS。DcCHS包括1 173 bp的開放閱讀框，99 bp的5′非編碼區(qū)和184 bp的3′非編碼區(qū)（圖3）。為了驗證拼接結(jié)果的正確性，設(shè)計引物對預(yù)測的閱讀框架序列進行擴增，得到大小約1 200 bp的片段（圖2-D），序列測定結(jié)果與拼接結(jié)果序列完全一致。

2.2 生物信息學(xué)分析

推導(dǎo)的DcCHS與中國水仙（AFM36767.1）、小蒼蘭雜交種（AEO45114.1）、陸地棉（AEO96985.1）、三角葉楊（XP_002303820.1）、咖啡黃葵（AGW22222.1）、黃蜀葵（ACE60221.1）、甜橙（XP_006489796.1）、圓葉葡萄（ACN30003.1）等植物的CHS蛋白氨基酸序列同源性高于84%以上。DcCHS含有CHS蛋白共有的高度保守的CHS_like（16-384）和PLN03171（1-389）結(jié)構(gòu)域，具有Ferrer等[28]對苜蓿CHS三維晶體結(jié)構(gòu)研究中發(fā)現(xiàn)的Cys164、His303和Asn336三個活性位點，以及Kim等[29]對甘薯塊根發(fā)育的研究中提到的2個決定底物特異性的苯丙氨酸殘基Phe215、Phe265和一個極其保守的信號序列G378FGPG。功能域預(yù)測其4-228位為N末端蛋白，238-387位為C末端蛋白，而156-172位為查爾酮合酶活性位點。

對9種植物的CHS蛋白序列進行同源比對（圖4），發(fā)現(xiàn)CHS在植物中的保守性很強。進一步分析其進化親緣關(guān)系，發(fā)現(xiàn)海南龍血樹與中國水仙、苜蓿的親緣關(guān)系最近，而與同是單子葉植物的粳稻、玉米和高粱的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖5）。

對DcCHS蛋白進行理化性質(zhì)及功能結(jié)構(gòu)預(yù)測，推測該蛋白相對分子量為42.7 ku，等電點pI 6.14。其氨基酸含量最高的為亮氨酸，高達(dá)9.7%，這與CHS通過亮氨酸拉鏈來參與同源二聚體形成有關(guān)[30]。其半衰期小于30 h，脂溶性系數(shù)為91.79，穩(wěn)定性極差。具有15個磷酸化位點（7個Ser，6個Thr，2個Tyr）（圖3）。無跨膜結(jié)構(gòu)，無信號肽，這點與絕大部分的CHS相一致。亞細(xì)胞定位在細(xì)胞質(zhì)的系數(shù)為18.5，細(xì)胞質(zhì)與核上為13.5，線粒體內(nèi)膜上為9.0。通過LOOPP預(yù)測其蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)圖及SWISS-MODEL預(yù)測三級結(jié)構(gòu)（圖6）。

2.3 DcCHS的組織特異性表達(dá)分析

定量PCR分析結(jié)果表明，海南龍血樹花中DcCHS表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于根、莖、葉和果實，而莖中表達(dá)量最低（圖7）。黃酮類化合物代謝途徑中一個常見的通路為花青素合成通路，而大量研究結(jié)果表明，CHS與花色有著密切的聯(lián)系[31]。根據(jù)DcCHS在花中的特異性表達(dá)，推測該基因可能參與花色素的形成。

3 討論與結(jié)論

目前一些植物的CHS相繼被克隆[11-17]，在GenBank中也有海南龍血樹CHS片段序列提交，但到目前為止還未見海南龍血樹完整的CHS序列和表達(dá)分析的報道。本研究從海南龍血樹克隆到DcCHS全長基因，該基因編碼的蛋白質(zhì)具有CHS家族保守存在的功能位點及結(jié)構(gòu)域。對DcCHS蛋白的分析，為進一步研究DcCHS在海南龍血樹中黃酮類化合物合成途徑中的功能提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。此外，作為黃酮類化合物代謝途徑的第一個關(guān)鍵限制酶，其表達(dá)情況可能會對血竭的形成及品質(zhì)造成影響。利用熒光定量PCR技術(shù)研究DcCHS在海南龍血樹中組織特異性表達(dá)情況，結(jié)果表明，在正在結(jié)果的海南龍血樹上，其花中DcCHS表達(dá)量最高，推測該基因可能參與花色素形成。在高等植物中CHS以基因家族的形式存在，而且具有組織特異性[18-20]，進一步分離龍血樹CHS基因家族的成員并進行相關(guān)表達(dá)分析，探討其與血竭形成的關(guān)系，將有助于闡明血竭形成的分子機制。

通過改變植物次生代謝產(chǎn)物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因的表達(dá)來提高次生代謝物的產(chǎn)量已有報道，如在青蒿中過量表達(dá)法尼基焦磷酸合酶基因，青蒿素的含量與對照相比提高了4倍[32]；Daudonnet等將來源酵母的法尼基焦磷酸合酶基因在煙草中超表達(dá)，固醇和胡蘿卜素的水平得到提高[33]。如果在海南龍血樹中提高DcCHS的表達(dá)量，就有可能提高海南龍血樹的黃酮類化合物的量，從而提高血竭的產(chǎn)量。目前海南龍血樹的轉(zhuǎn)基因體系還不成熟，通過轉(zhuǎn)基因在海南龍血樹中過量表達(dá)DcCHS還很困難。但通過對DcCHS的表達(dá)與調(diào)控機制的深入研究，將有可能通過激素或化學(xué)調(diào)控等方式調(diào)控DcCHS的表達(dá)來提高血竭的產(chǎn)量。

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責(zé)任編輯：沈德發(fā)