橡膠樹(shù)AGPase一個(gè)大亞c基DNA全長(zhǎng)克隆及表達(dá)分析

鄭乾坤等

摘 要 ADP葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）是淀粉合成起始的關(guān)鍵酶，利用保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，得到一條橡膠樹(shù)AGPase大亞基的類似序列，再以木質(zhì)部cDNA為模板通過(guò)RACE（Rapid amplification of cDNA ends）技術(shù)克隆得到AGPase基因的cDNA全長(zhǎng)，命名為HbLSUI（GenBank NO：KJ020930）。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，AGPase基因所編碼的蛋白具有AGPase大亞基保守結(jié)構(gòu)域。RT-PCR表達(dá)分析結(jié)果表明，AGPase基因在木質(zhì)部和樹(shù)皮中的表達(dá)量較高。利用熒光定量PCR分析AGPase基因在不割膠、常規(guī)割膠和乙烯刺激割膠3種割膠強(qiáng)度下的表達(dá)情況，結(jié)果表明，割膠和刺激割膠可導(dǎo)致該基因的表達(dá)量降低。

關(guān)鍵詞 橡膠樹(shù)；AGPase；淀粉；定量PCR

中圖分類號(hào) S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Cloning of One Full-length AGPase Large

Subunit cDNA Sequence and Expression Analysis

ZHENG Qiankun1， WEI Fang2， LUO Shiqiao2，

WU Ming2， QIU Jian2， YANG Wenfeng2， XIAO Xianzhou1，2*

1 College of Agronomy， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

2 Rubber Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key Laboratory of

Biology and Genetic Resources of Rubber Tree， Ministry of Agriculture， Danzhou， Hainan 571737， China

Abstract ADP glucose pyrophosphorylase（AGPase）is a key enzyme to the process of starch synthesis. In this research， one cDNA sequence of AGPase large subunit was isolated from rubber tree xylem by RACE（rapid amplification of cDNA ends）technique， named HbLSUI（Genebank NO：KJ020930）. Bioinformatic analysis showed that HbLSUI had the conserved domains of AGPase large subunit. Semi-quantitative PCR indicated the transcripts of HbLSUI was abundant in xylem and bark. Quantitative PCR indicated： tapping and ethylene stimulate tapping reduced the transcript levels of HbLSUI significantly.

Key words Hevea brasiliensis；AGPase；Starch；Quantitative PCR

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.08.013

淀粉是高等植物中主要的貯藏碳水化合物，是植物中最豐富和最重要的儲(chǔ)備多糖，是能量來(lái)源最重要的物質(zhì)之一。巴西橡膠樹(shù)是一種產(chǎn)膠植物，橡膠合成的前體分子是蔗糖，而蔗糖可由淀粉降解而來(lái)，因此，淀粉與橡膠合成之間存在一定的相關(guān)性。但由于淀粉并不是合成橡膠的直接原材料，關(guān)于橡膠樹(shù)中淀粉代謝方面的研究較少。近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的刺激割膠大幅度地提高了橡膠的產(chǎn)量，但由于割膠強(qiáng)度較大，不可避免的需要?jiǎng)訂T儲(chǔ)藏碳庫(kù)來(lái)供應(yīng)原料供應(yīng)，這個(gè)過(guò)程中淀粉的作用不可忽略。

植物在進(jìn)行光合作用時(shí)，除了產(chǎn)生滿足當(dāng)前需要的碳水化合物外，剩余的碳水化合物被植物儲(chǔ)藏用于代謝系統(tǒng)的維護(hù)和再生[1]。作為光合作用最重要的終產(chǎn)物，淀粉被運(yùn)輸?shù)剿璧母鱾€(gè)組織和器官，但大多數(shù)是作為儲(chǔ)存性的物質(zhì)儲(chǔ)存以備動(dòng)用，特別是在光合作用不足以滿足生長(zhǎng)和發(fā)育需求的時(shí)候，植物就會(huì)動(dòng)用它自身儲(chǔ)存的非結(jié)構(gòu)性多糖[2]。在一些特定的情況下，如植株遭受傷害或者闊葉植物早春生長(zhǎng)時(shí)，橡膠樹(shù)由于割膠和強(qiáng)度割膠時(shí)，此時(shí)光合作用的即時(shí)供應(yīng)滿足不了植株需求，儲(chǔ)藏物質(zhì)被動(dòng)員起來(lái)用于支持植物度過(guò)高能量消耗期[3]。

淀粉在動(dòng)員之前需要先完成淀粉的積累過(guò)程，淀粉的合成是個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，而ADP葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-glucose pyrophosphorylase，AGPase）是淀粉合成起始的關(guān)鍵酶，淀粉合成關(guān)鍵步驟是ADP-葡萄糖在AGPase催化下的合成[4]。ADP-葡萄糖在植物的光合組織和非光合組織中都具有重要的作用[5]。ADP-葡萄糖是葡萄糖基的供體，也是合成淀粉的底物。在真核生物中，AGPase是由2個(gè)不同的亞基組成的四聚體，包括2個(gè)大亞基和2個(gè)小亞基蛋白。在許多作物中，如菠菜、馬鈴薯、甘薯、西紅柿、小麥、鷹嘴豆、水稻、玉米、柑橘的AGPase的亞基基因均已被克隆，并且有很多已經(jīng)做了表達(dá)分析[6-16]。AGPase的基因功能與淀粉合成也有一定的關(guān)聯(lián)，姚慶榮等[17]將該基因轉(zhuǎn)化得到了轉(zhuǎn)基因的煙草，并獲得了淀粉含量較高的轉(zhuǎn)基因煙草。Smidansky等[18]將玉米的AGPase基因轉(zhuǎn)入小麥中，結(jié)果獲得了籽粒和生物量都增加的轉(zhuǎn)基因小麥。

目前，有關(guān)橡膠樹(shù)AGPase基因在分子生物學(xué)方面的研究還處于空白。本研究從巴西橡膠樹(shù)中克隆得到一條AGPase大亞基基因的cDNA序列，命名為HbLSUI，并對(duì)該基因的表達(dá)特征進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材料

基因全長(zhǎng)克隆以開(kāi)割后PR107品種的橡膠樹(shù)木質(zhì)部作為材料，組織特異性分析采用橡膠樹(shù)的不同組織（分別是橡膠樹(shù)的木質(zhì)部、樹(shù)皮、葉片、膠乳和根）作為實(shí)驗(yàn)材料提取RNA。

不同割膠強(qiáng)度下的材料取樣方法：在試驗(yàn)場(chǎng)七隊(duì)選取開(kāi)割后的橡膠樹(shù)，品種為PR107，于1982年定植，1990年開(kāi)割。選取3組橡膠樹(shù)分別作為對(duì)照、常規(guī)割膠和刺激割膠，每組3個(gè)重復(fù)，對(duì)選取的橡膠樹(shù)不割膠處理3個(gè)月，9月開(kāi)始取樣，取割線下方2～3 cm處的樹(shù)皮和木質(zhì)部樣品作為實(shí)驗(yàn)材料提取RNA。經(jīng)過(guò)2個(gè)月的常規(guī)割膠（1/2 s，3 d）和乙烯刺激割膠（1/2 s，3 d+ET），11月再次取割線下方2～3 cm處的樹(shù)皮和木質(zhì)部樣品作為實(shí)驗(yàn)材料提取RNA。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄 RNA的提取采用百泰克RNA提取試劑盒提取（具體方法參照說(shuō)明書(shū)）。反轉(zhuǎn)錄是利用Ferments反轉(zhuǎn)錄試劑盒完成（具體方法參照說(shuō)明書(shū)）。

1.2.2 利用RACE技術(shù)克隆大亞基基因 利用AGPase簡(jiǎn)并引物（SenseP和AntiP）克隆部分序列，通過(guò)RACE技術(shù)擴(kuò)增基因全長(zhǎng)，接頭引物為UMP和NUP，正向引物為5′GSP和5′NGSP，反向引物為3′GSP和3′NGSP（表1）。得到的電泳序列經(jīng)過(guò)凝膠回收試劑盒（Axygen，KE10101003-G）純化回收后連接到pEASY-T1（Transgen）載體上，并送北京華大基因測(cè)序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 等電點(diǎn)分子量預(yù)測(cè)：利用在線（http：//web.expasy.org/compute_pi/）工具預(yù)測(cè)該基因表達(dá)蛋白的等電點(diǎn)；亞細(xì)胞定位：利用在線的（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）singalP工具對(duì)該基因表達(dá)的蛋白進(jìn)行定位預(yù)測(cè)；功能域預(yù)測(cè)：利用ncbi（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）工具對(duì)該基因的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了預(yù)測(cè)和比對(duì)。

1.2.4 表達(dá)分析 分別提取橡膠樹(shù)木質(zhì)部、樹(shù)皮、葉片、膠乳和根的RNA，通過(guò)RT-PCR得到cDNA模板，以18S rRNA（GenBank登陸號(hào)：AB268099）（引物：18S-FP、18S-RP）作為內(nèi)參基因調(diào)節(jié)模板濃度，通過(guò)半定量PCR法分析不同組織中該基因的表達(dá)情況，半定量的最佳循環(huán)數(shù)為26個(gè)循環(huán)。利用熒光定量PCR法分析HbLSUI在不同割膠強(qiáng)度下（對(duì)照、常規(guī)、刺激）的表達(dá)情況。利用重復(fù)不等隨機(jī)單因子的分析方法對(duì)其差值做差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 RACE結(jié)果及序列分析

克隆得到一條AGPase大亞基基因序列，經(jīng)過(guò)測(cè)序，其全長(zhǎng)為1 696 bp（GenBank登錄號(hào)：KJ020930），預(yù)測(cè)編碼527個(gè)氨基酸，5′-UTR有59 bp，3′-UTR有53 bp，理論預(yù)測(cè)推導(dǎo)氨基酸分子量為58.399 ku，等電點(diǎn)為7.18。通過(guò)SignalP分析，該推導(dǎo)序列定位在細(xì)胞質(zhì)中，屬于胞質(zhì)型大亞基。該基因序列編碼的蛋白序列與蓖麻、楊樹(shù)的序列有較高的同源性，分別為89%和86%（表2）。

HbLSUI推導(dǎo)的氨基酸序列見(jiàn)圖1，與已經(jīng)鑒定功能的玉米（ZmLSU，GenBank NO：S48563）保守結(jié)構(gòu)域[13]的比較分析，結(jié)果表明該推導(dǎo)序列包含AGPase大亞基的5個(gè)功能區(qū)序列，橫線部分依次是：191～199：ATP結(jié)合區(qū)（ATP-binding motif）；222～231：催化區(qū)（Catalytic motif）；271～280：GTP結(jié)合區(qū)（GTP-binding motif）；376～429：亞基結(jié)合區(qū)（Between-subunit interaction motif）；511～527：調(diào)控區(qū)（Regulation motif）。初步證明推導(dǎo)的氨基酸序列具有AGPase大亞基蛋白的功能。

2.2 HbLSUI基因的表達(dá)模式分析

雖然HbLSUI基因從木質(zhì)部中克隆得到，但該基因在不同組織中均有表達(dá)。由圖2可以看出，HbLSUI基因在不同組織中的表達(dá)情況不同，在木質(zhì)部、樹(shù)皮中的表達(dá)量比在葉片、膠乳中的表達(dá)量高。

2.3 割膠對(duì)HbLSUI基因表達(dá)的影響

為了更深入的了解淀粉在樹(shù)皮和木質(zhì)部的合成，分別在割膠和刺激割膠條件下，研究HbLSUI基因的表達(dá)分析情況。通過(guò)熒光定量PCR，得到HbLSUI在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)于不同割膠強(qiáng)度的反應(yīng)，由于樹(shù)皮與木質(zhì)部中淀粉的積累情況區(qū)別較大，因此，本研究對(duì)2個(gè)部位分別進(jìn)行了分析。

由圖3可以看出，在木質(zhì)部中，9月實(shí)驗(yàn)前HbLSUI的表達(dá)量顯著高于11月實(shí)驗(yàn)后的表達(dá)量。經(jīng)過(guò)11月常規(guī)割膠和刺激割膠后，HbLSUI的表達(dá)量比對(duì)照明顯降低。

為了排除物候的影響，本研究選取前后2次取樣的結(jié)果，利用重復(fù)不等隨機(jī)單因子的分析方法對(duì)其差值做差異顯著性分析，結(jié)果表明，刺激割膠和常規(guī)割膠下，木質(zhì)部中該基因的表達(dá)量顯著低于對(duì)照（圖3）。在樹(shù)皮中，刺激和常規(guī)割膠下，HbLSUI的表達(dá)量也顯著降低（圖4），與木質(zhì)部的表達(dá)結(jié)果吻合。

3 討論與結(jié)論

橡膠樹(shù)淀粉的消長(zhǎng)規(guī)律是重要的割膠理論基礎(chǔ)，包括合成和降解2個(gè)過(guò)程，淀粉的合成是一種正向的積累碳源的過(guò)程，對(duì)其進(jìn)行研究有助于更好地理解消長(zhǎng)規(guī)律。AGPase是淀粉合成過(guò)程的關(guān)鍵酶，該研究通過(guò)RACE技術(shù)從橡膠樹(shù)木質(zhì)部克隆得到一個(gè)AGPase大亞基基因的cDNA全長(zhǎng)序列（HbLSUI），經(jīng)過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn)與其同科的蓖麻同源性較高， 屬于胞質(zhì)型大亞基， 與已報(bào)道的玉米、柑橘、毛果楊[12-13]等大亞基基因的結(jié)構(gòu)域相似，具有AGPase大亞基蛋白的5個(gè)功能區(qū)。

HbLSUI在木質(zhì)部和樹(shù)皮中的表達(dá)量較高，而在葉片中的表達(dá)量較低，這種表達(dá)模式與其他植物不同。大多數(shù)植物AGPase的組織特異性表達(dá)表現(xiàn)為葉片表達(dá)高，如康國(guó)章等[9，19]在對(duì)小麥的研究中發(fā)現(xiàn)AGPase大亞基基因在小麥的葉片中表達(dá)量最高，莖和根表達(dá)量相對(duì)較低；類似的研究在木本植物柑橘[12]和鷹嘴豆[4]的研究中也得到證實(shí)。推測(cè)該基因在橡膠樹(shù)中的表達(dá)具有特異性，在木質(zhì)部和樹(shù)皮中的表達(dá)較其他組織活躍。

在樹(shù)皮中，淀粉作為即時(shí)的緩沖；木質(zhì)部中，淀粉可以看做一種長(zhǎng)效儲(chǔ)藏源[19]，淀粉在2個(gè)部分的作用不同。HbLSUI表達(dá)受物候影響較大，包括對(duì)照在內(nèi)，不同強(qiáng)度割膠下，木質(zhì)部中HbLSUI基因在9月和11月的表達(dá)量發(fā)生了顯著變化，9月的表達(dá)量顯著高于11月的。9月光照充足，光合作用旺盛，橡膠樹(shù)處于代謝旺產(chǎn)期，11月氣溫降低，光合作用減弱，淀粉合成減慢；這種狀況同樣出現(xiàn)在樹(shù)皮中，可見(jiàn)木質(zhì)部和樹(shù)皮中淀粉合成與HbLSUI有關(guān)。常規(guī)割膠和刺激割膠對(duì)樹(shù)皮和木質(zhì)部中HbLSUI轉(zhuǎn)錄水平都產(chǎn)生了影響，差異顯著性分析結(jié)果表明，割膠引起HbLSUI的表達(dá)比對(duì)照降低，而且割膠強(qiáng)度大的刺激割膠處理降低程度更大，分析原因，推測(cè)是割膠傷害對(duì)表達(dá)產(chǎn)生了影響，組織細(xì)胞學(xué)研究結(jié)果表明，持續(xù)割膠導(dǎo)致割面最近處膠乳再生區(qū)的樹(shù)皮軟組織淀粉短缺[20]，Junjittakarn等[21]認(rèn)為割膠引起的短期效應(yīng)導(dǎo)致碳源的局部沉默，由于本研究取樣部位是割線附近，也可能是持續(xù)傷害僅對(duì)割線處HbLSUI的表達(dá)產(chǎn)生負(fù)面影響。割膠引起HbLSUI的表達(dá)降低，而Silpi等[22-23]在對(duì)橡膠樹(shù)樹(shù)干的研究中認(rèn)為，割膠引起了樹(shù)干淀粉的積累，在割面上部離割面越近積累效果越顯著，鑒于以上研究，割膠對(duì)于淀粉的合成存在促進(jìn)還是抑制作用，有待進(jìn)一步討論。

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責(zé)任編輯：黃東杰