櫻桃番茄種質(zhì)資源親緣關(guān)系的InDel和SSR標(biāo)記分析

郭爽等

摘 要 選用18對(duì)InDel引物和15對(duì)SSR引物對(duì)30份櫻桃番茄高代自交系育種材料進(jìn)行遺傳多樣性分析。多態(tài)性分析結(jié)果表明，InDel標(biāo)記比SSR標(biāo)記的多態(tài)性低；遺傳距離分析結(jié)果表明，30份櫻桃番茄種質(zhì)材料兩兩間的遺傳距離（GD）在0.052～0.993之間，平均遺傳距離僅為0.391，遺傳距離小于0.5的種質(zhì)材料占到了77.24%。在相似系數(shù)為0.65的水平上，可將30份櫻桃番茄材料分為3類。

關(guān)鍵詞 櫻桃番茄；親緣關(guān)系；InDel標(biāo)記；SSR標(biāo)記

中圖分類號(hào) S641.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Phylogenetic Relationship Analysis of Cherry Tomato

Germplasm Using InDel And SSR Markers

GUO Shuang， ZHANG Suping， QIU Manyu， LIU Yuping， WU Bei

Guangzhou Academy of Agricultural Sciences， Guangzhou， Guangdong 510308， China

Abstract Eighteen InDel and 25 SSR primers were used to study the genetic diversity among 30 cherry tomato germplasm resources. The result of polymorphism analysis indicated that InDel markers showed lower polymorphisms than SSR markers. The genetic distance of 30 cherry tomato materials was 0.052～0.993. The average genetic distance was 0.391. Germplasm materials with genetic distance less than 0.5 accounted for 77.24%. The result of cluster analysis showed that 30 cherry tomato germplasm resources could be classified into 3 groups.

Key words Cherry tomato； Phylogenetic relationship； SSR markers； InDel markers

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.08.002

櫻桃番茄（Lycopersicon esculentum Mill. var. cerasiforme Alef.）又名小西紅柿、圣女果，為茄科番茄屬一年生草本植物，是一種水果型蔬菜，集水果、蔬菜、觀賞于一體，深受廣大消費(fèi)者青睞。目前櫻桃番茄生產(chǎn)中，國(guó)外品種占據(jù)我國(guó)主要市場(chǎng)，因此加強(qiáng)擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)、能參與國(guó)際市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)的櫻桃番茄新品種的選育具有重大意義。遺傳多樣性是作物育種與改良的重要基礎(chǔ)。但櫻桃番茄是一種嚴(yán)格的自花授粉植物，在長(zhǎng)期的育種實(shí)踐中，櫻桃番茄的遺傳背景逐漸變窄。因此，豐富的種質(zhì)資源對(duì)櫻桃番茄新品種的選育極其重要。

隨著番茄基因組序列的公開(kāi)，基于全基因組重測(cè)序的InDel標(biāo)記，因其具有在基因組內(nèi)分布廣、密度高、變異穩(wěn)定、多態(tài)性強(qiáng)、檢測(cè)容易等優(yōu)點(diǎn)，受到越來(lái)越多關(guān)注。目前基于全基因組的InDel標(biāo)記在水稻[1]、玉米[2]、番茄[3]、黃瓜[4]等作物中已有應(yīng)用，但在櫻桃番茄作物上的應(yīng)用尚無(wú)報(bào)道。

本研究通過(guò)分析InDel標(biāo)記和SSR標(biāo)記在30份櫻桃番茄種質(zhì)資源中的多態(tài)性，探索InDel標(biāo)記在櫻桃番茄分子育種中的應(yīng)用潛力。同時(shí)通過(guò)對(duì)現(xiàn)有的高代自交系材料進(jìn)行聚類分析，明確供試材料間的遺傳距離，旨在為櫻桃番茄利用雜交優(yōu)勢(shì)進(jìn)行品種選育和改良育種提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)共選擇了30份櫻桃番茄育種材料（表1），均是廣州市農(nóng)科院多年收集并分離自交純化的高代自交系材料。其中27份為無(wú)限生長(zhǎng)類型，3份為自封頂類型。櫻桃番茄果形涉及圓形、高圓形、長(zhǎng)圓形、梨形等；果色有紅色、綠色、黃色、淺黃等。2012年8月4日播種于廣州市農(nóng)科院花都實(shí)驗(yàn)基地，9月1日定植，待幼苗長(zhǎng)至6～7片真葉時(shí)，混株取3～4片嫩葉于2 mL離心管中，-20 ℃保存，以備提取DNA。

1.2 試驗(yàn)方法

利用15對(duì)SSR引物和18對(duì)InDel特異引物對(duì)櫻桃番茄種質(zhì)材料進(jìn)行遺傳多樣性分析。引物序列由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)蔬菜學(xué)系楊文才教授提供，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.1 DNA提取 采用改良的CTAB法[5]提取櫻桃番茄總DNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA條帶的完整性，UV9100B型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定吸光度值，檢測(cè)純度和濃度，并將其稀釋為20 ng/μL，-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴(kuò)增 擴(kuò)增反應(yīng)在Thermo PX2 PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)體系25 μL，包括2.5 μL 10×PCR buffer、1.6 mmol/L MgCl2 1.5 μL、0.2 μmol/L dNTPs 2 μL、0.36 μmol/L 引物正反向各1 μL、2.5 U Taq酶0.2 μL、20 ng/μL模板DNA 1 μL、ddH2O 15.8 μL。PCR的反應(yīng)過(guò)程為：94 ℃預(yù)變性3 min，然后為94 ℃變性1 min，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%變性聚丙稀酰胺膠上電泳，銀染檢測(cè)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

在擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜中的同一遷移位置上按條帶有無(wú)分別賦值，有擴(kuò)增條帶的標(biāo)記為1，無(wú)擴(kuò)增條帶的標(biāo)記為0，得到各樣品帶型分布表。

根據(jù)公式PICi=1-Pij2來(lái)計(jì)算引物的多態(tài)性信息含量（Polymorphism information content，PIC），公式中，Pij表示標(biāo)記i的第j個(gè)帶型出現(xiàn)的頻率，標(biāo)記i的總帶型從1到n。

采用NTSYS pc-2.10軟件進(jìn)行聚類分析。對(duì)原始矩陣用Similarity程序中的Genetic distance計(jì)算樣本間的遺傳距離，并獲得遺傳距離矩陣。用Clustering程序中的SAHN程序進(jìn)行聚類分析，并通過(guò)Graphics程序中的Tree plot模塊生成聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記分析

15對(duì)SSR引物對(duì)30份櫻桃番茄種質(zhì)材料的分子標(biāo)記鑒定結(jié)果表明（表2），共有13對(duì)引物可以在櫻桃番茄種質(zhì)材料上擴(kuò)增出條帶，其中11對(duì)引物具有比較清晰的多態(tài)性條帶，產(chǎn)生多態(tài)性擴(kuò)增的引物比率為84.6%。13對(duì)引物共擴(kuò)增出52條帶，多態(tài)性帶42條，占總條帶數(shù)的80.77%，擴(kuò)增片段大小在100～1 000 bp之間。平均每對(duì)引物可擴(kuò)增出4條帶，其中擴(kuò)增條帶最多的引物為SSR13，共6條帶；擴(kuò)增條帶最少的為SSR32和SSR43，僅有2條帶。各引物多態(tài)性信息含量（PIC）分布在0.66～0.92之間，平均為0.68。引物SSR13的PIC值最大，為0.92，這對(duì)引物在本試驗(yàn)的樣本群體中具有較好的多態(tài)性。

2.2 InDel標(biāo)記分析

從18對(duì)InDel引物中挑選出12對(duì)在30份櫻桃番茄材料都能產(chǎn)生清晰條帶的引物（表3）。這12對(duì)引物共擴(kuò)增出38條帶，其中多態(tài)性條帶22條，占總條帶數(shù)的57.9%。平均每對(duì)引物可擴(kuò)增出3.2條帶，提供1.8個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。這12對(duì)引物擴(kuò)增到的等位基因數(shù)在2～5之間，其中擴(kuò)增條帶最多的引物為SL20210i，共5條帶，提供4個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。平均每個(gè)引物對(duì)產(chǎn)生的多態(tài)性條帶比率（PPB）為52.5%。各引物多態(tài)性信息含量（PIC）分布在0.52～0.87之間，平均為0.52。與SSR標(biāo)記的平均多態(tài)性信息含量（PIC）相比，InDel標(biāo)記的多態(tài)性水平較SSR標(biāo)記的多態(tài)性低。

2.3 基于SSR和InDel標(biāo)記的遺傳距離分析

遺傳距離是衡量樣品間相似程度的度量，遺傳距離數(shù)值越大表明材料間的差異越明顯[6]。30份櫻桃番茄種質(zhì)材料兩兩間的遺傳距離（GD）在0.052～0.993之間，平均遺傳距離為0.391。編號(hào)12與編號(hào)13 2份材料之間的遺傳距離最小，僅為0.052，因?yàn)檫@2份材料是從同一株系分離出的姐妹系，盡管在果實(shí)大小方面存在一定差異，但是從分子水平檢測(cè)，兩者的遺傳背景還是較相近的，推測(cè)這2份材料外觀水平上的差異可能是由于環(huán)境因素造成的；編號(hào)3與編號(hào)17 2份材料之間的遺傳距離最大，為0.993，這2份材料從外觀上看，在果色和果實(shí)大小上就存在較大差異?？傮w來(lái)看，30份櫻桃番茄種質(zhì)材料兩兩間的遺傳距離呈偏態(tài)分布（圖1），遺傳距離小于0.5的種質(zhì)材料組合占到了77.24%，表明現(xiàn)有櫻桃番茄種質(zhì)材料的遺傳背景較狹窄。兩兩間遺傳距離大于0.7的種質(zhì)材料共有16對(duì)，表明這些材料間的遺傳差異較大，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，可以據(jù)此指導(dǎo)田間的育種實(shí)踐，為田間親本材料的選擇和選配提供科學(xué)依據(jù)。

2.4 基于SSR和InDel標(biāo)記的聚類分析

30份櫻桃番茄材料相似系數(shù)的變異范圍在0.345～0.948之間（圖2），平均為0.681。編號(hào)12與編號(hào)13的2份材料間相似系數(shù)最高，為0.948，與遺傳距離計(jì)算結(jié)果相同。在相似系數(shù)為0.65的水平上，可將30份櫻桃番茄材料分為三類，第一類共有12份材料，包括11份無(wú)限生長(zhǎng)型和1份自封頂型材料；第二類共16份材料，包括14份無(wú)限生長(zhǎng)型和2份自封頂型材料；第三類共有2份材料，均為無(wú)限生長(zhǎng)類型。在育種實(shí)踐中，可以考慮有目的地將不同類群間的種質(zhì)材料配制雜交組合，一方面篩選優(yōu)良組合，另一方面可以將某些優(yōu)質(zhì)組合繼續(xù)自交純化，創(chuàng)制新種質(zhì)，盡可能擴(kuò)大和豐富櫻桃番茄的遺傳背景。

3 討論與結(jié)論

DNA分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，為種質(zhì)資源親緣關(guān)系的研究和育種效率的提高提供了新的思路和途徑。姚祝平等[7]利用AFLP分子標(biāo)記對(duì)44份番茄材料進(jìn)行了遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析，從64對(duì)引物組合中篩選出15對(duì)用于擴(kuò)增，共獲得364條多態(tài)性條帶，將44份番茄材料分成5個(gè)復(fù)合組和1個(gè)獨(dú)立組。本課題組在番茄遺傳多樣性的研究中，選用了育種實(shí)踐中用于配制雜交雜組合的20份高代純系番茄育種材料進(jìn)行親緣關(guān)系分析[8]，并將聚類結(jié)果指導(dǎo)育種實(shí)踐，選育出抗青枯病番茄新品種‘益豐2號(hào)[9]。本研究選用櫻桃番茄高代自交系育種材料作為供試材料，分析它們之間的遺傳多樣性，意在從分子水平分析這些育種材料間的遺傳背景，一方面為田間育種實(shí)踐提供理論依據(jù)和參考，減少雜交組合選配的盲目性，另一方面，將實(shí)驗(yàn)室分子水平親緣關(guān)系分析與田間實(shí)踐相結(jié)合，探尋自花授粉作物遺傳背景趨于狹窄的出路。本研究選用的30份櫻桃番茄高代自交系材料在其田間農(nóng)藝性狀上各具特色，無(wú)從取舍，親本的選擇和選配沒(méi)有依據(jù)可尋。但通過(guò)基于分子水平的聚類分析，很明確地將材料聚成了三大類，在育種實(shí)踐中，可以考慮有目的地將不同類群間的種質(zhì)材料配制雜交組合，產(chǎn)生較強(qiáng)的雜種優(yōu)勢(shì)。

本研究選用的18對(duì)InDel標(biāo)記中，表現(xiàn)多態(tài)性的有8對(duì)引物，占InDel標(biāo)記總數(shù)的44.4%，而15對(duì)SSR標(biāo)記中，表現(xiàn)多態(tài)性的有11對(duì)引物，占SSR標(biāo)記總數(shù)的73.3%，表明InDel標(biāo)記的多態(tài)性水平比SSR標(biāo)記低很多，這與在水稻[10]、大果型番茄[3]上的研究結(jié)論相同。在番茄基因組中，雖然InDel標(biāo)記數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)多過(guò)SSR標(biāo)記，但是它較低的多態(tài)性水平在一定程度上限制了InDel標(biāo)記的應(yīng)用范圍。

本研究中，30份櫻桃番茄種質(zhì)材料兩兩間的遺傳距離（GD）在0.052～0.993之間，平均遺傳距離僅為0.391，遺傳距離小于0.5的種質(zhì)材料占到了77.24%，表明現(xiàn)有櫻桃番茄種質(zhì)材料的遺傳背景較狹窄，這可能是由于馴化、育種選擇[11]以及櫻桃番茄自身的自花授粉特性造成的，這與申璐[3]等人的研究結(jié)論相同。因此，在櫻桃番茄育種中，應(yīng)注重選用外來(lái)資源，包括國(guó)外引進(jìn)資源和野生資源來(lái)拓寬種質(zhì)資源的遺傳基礎(chǔ)。

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責(zé)任編輯：葉慶亮