鶯歌海鹽場30%鹽度曬鹽池底泥中可培養(yǎng)芽胞桿菌資源遺傳多樣性研究

周秋平等

摘 要 采用80 ℃水浴處理與稀釋涂布法從鶯歌海鹽場30%鹽度曬鹽池底泥中分離獲得215株芽胞桿菌。采用16S rDNA PCR-RFLP與16S rDNA序列分析技術(shù)，對分離的菌株進行遺傳多樣性分析。16S rDNA PCR-RFLP酶切圖譜UPGMA聚類分析結(jié)果表明，在100%的相似性水平上，分離菌株歸屬到9種酶切類型。16S rDNA測序結(jié)果顯示，這些菌株主要分布在Pontibacillus、Halobacillus、Oceanobacillus和Bacillus等4個屬，其中Pontibacillus為優(yōu)勢屬。有7株芽胞桿菌的16S rDNA序列與數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)模式菌的最大相似性在97.4%～99.0%之間，有可能為芽胞桿菌新種資源。

關(guān)鍵詞 芽胞桿菌；多樣性；16S rDNA PCR-RFLP；系統(tǒng)發(fā)育分析

中圖分類號 S476.1 文獻標識碼 A

Abstract 215 Bacillus-like bacterial strains were obtained from Yinggehai Saltern sediment of 30% salinity salt pond by using the method of 80 ℃ water bath treatment and diluting spread. The genetic diversities were analyzed by 16S rDNA PCR-RFLP and 16S rRNA gene sequence analysis. In the similarity level of 100%， cluster analysis of UPGMA map and 16S rDNA PCR-RFLP macrorestriction map showed that the isolates were grouped into 9 clusters， including genus Pontibacillus， Halobacillus， Oceanobacillus and Bacillus， in which Pontibacillus was the dominant one. Based on the comparison of 16S rRNA gene sequences， the highest similarities of seven strains with the corresponding type strains ranged from 97.4% to 99.0%. The results showed that culturable Bacillus-like species from Yinggehai Saltern sediment revealed high genetic diversity and there existed some novel species.

Key words Bacillus-like species； Diversity； 16S rDNA PCR-RFLP； Phylogeny analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.09.028

芽胞桿菌為土壤細菌中的常見類群，是一類好氧或兼性厭氧、革蘭氏染色多為陽性、能產(chǎn)生芽胞的化能異養(yǎng)型細菌，廣泛分布于各種生態(tài)環(huán)境中，如水體[1]、土壤[2]、深海沉積物[3]。芽胞桿菌種類繁多、數(shù)量巨大、能夠產(chǎn)生多種生理活性物質(zhì)和代謝產(chǎn)物。芽胞桿菌在工農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生、環(huán)保等領(lǐng)域具有廣泛的用途，如防治植物病蟲害[4]、處理工業(yè)廢水[5]等。

鶯歌海鹽場位于海南省樂東縣西南部海濱，是中國南方最大的海鹽廠，海灘涂地帶鹽田總面積37.97 km2，占全島鹽田總面積的63%，屬人工形成的海洋高鹽環(huán)境。高鹽環(huán)境中存在著獨特的微生物區(qū)系，過去對陸地高鹽環(huán)境中微生物的研究較多[6-11]，且發(fā)現(xiàn)芽胞桿菌屬為優(yōu)勢菌群。鶯歌海鹽場由一系列的曬鹽池組成，本研究對鶯歌海鹽場鹵水鹽度為30%曬鹽池底泥中的可培養(yǎng)芽胞桿菌資源進行分離培養(yǎng)及遺傳多樣性研究，為了解、利用極端環(huán)境中的芽孢桿菌資源奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 底泥樣品采集于鶯歌海鹽場鹵水鹽度為30%的曬鹽池。采用5點采樣法采集5～25 cm深的底泥50 g左右，放入無菌采樣袋中混合均勻，冰盒儲存，及時帶回實驗室進行菌株分離，剩余樣品置4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 培養(yǎng)基 R2A培養(yǎng)基：1 000 mL中含有可溶性淀粉10 g，酵母膏0.5 g，蛋白胨0.5 g，酸水解酪素0.5 g，葡萄糖 0.5 g，丙酮酸鈉0.3 g。PBMY培養(yǎng)基：1 000 mL中含有蛋白胨10 g，酵母膏3 g，牛肉膏0.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g。改良營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：1 000 mL中含有牛肉膏0.3 g，蛋白胨1 g。淡薄培養(yǎng)基：1 000 mL中含有酵母膏0.7 g，蛋白胨1 g，葡萄糖1 g，（NH4）2SO4 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，K2HPO4 1 g。所有培養(yǎng)基鹽濃度15%，采用30%的鹵水稀釋配制，pH7.0，瓊脂粉20～25 g/L。

1.2 方法

1.2.1 芽胞桿菌的分離純化 稱取10 g底泥樣品，放入盛有90 mL無菌鹵水的三角瓶中，置恒溫搖床中振蕩30 min（30 ℃、200 r/min）；將得到的懸液稀釋至10-1～10-6梯度，80 ℃水浴處理20 min以滅活非芽胞細菌；吸取熱處理后的懸液0.1 mL，涂布平板，于30 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，觀察菌落形狀、顏色等表型特征，挑單菌落劃線純化，直至得到純培養(yǎng)。

1.2.2 芽胞桿菌16S rDNA PCR-RFLP多樣性分析

基因組DNA的提取參照相關(guān)文獻[12]進行。選用以下引物（由上海生工生物技術(shù)有限公司合成）擴增16S rDNA基因：P1（5′-AGAGTTTGATCCTGGCT

CAGAACGAACGCT-3′），P6（5′-TACGGCTACCTTG

TTACGACTTCACCCC-3′）。PCR反應(yīng)程序為： 95 ℃ 15 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，共30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)MspⅠ（TaKaRa）酶切后，用3%瓊脂糖凝膠電泳檢測。用NTSYS-pc2.01軟件進行相似性分析，采用平均連鎖法（UPGMA）聚類，得出菌株間的聚類關(guān)系[13]。

1.2.3 16S rDNA序列測定及其系統(tǒng)發(fā)育分析

從16S rDNA PCR-RFLP分型的不同遺傳類型中，各選取1～2株菌進行16S rDNA測序（由上海生工生物工程有限公司完成）。將測序結(jié)果在EzTaxon server 2.1和GenBank 中進行BLAST比較分析。采用MEGA5.0以鄰位相連法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽胞桿菌的分離

采用80 ℃水浴處理與稀釋涂布相結(jié)合的方法，從4種培養(yǎng)基上共分離獲得芽胞桿菌215株。分離于R2A培養(yǎng)基的72株，占分離總數(shù)的33.5%；分離于PBMY培養(yǎng)基的61株，占28.4%；分離于改良營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的48株，占22.3%；分離于淡薄培養(yǎng)基的34株，占15.8%。在R2A培養(yǎng)基上生長的菌落，形態(tài)種類較多，而淡薄培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)較少。

2.2 鶯歌海鹽場曬鹽池底泥芽胞桿菌遺傳多樣性

從鶯歌海鹽場30%鹽度曬鹽池底泥中分離的215株芽胞桿菌，經(jīng)16S rDNA PCR-RFLP初步分型，每1個限制性片斷長度多態(tài)性類型代表1種酶切類型，共得到9種酶切類型，從9種類型中選出18株代表菌株的酶切圖譜見圖1。由代表菌株的聚類樹狀圖（圖2）可知，相似系數(shù)為0.62時，芽胞桿菌分為2個類群；相似系數(shù)為0.81時，分為7個類群；相似系數(shù)增大至1.00時，芽胞桿菌可分為9個類群。

2.3 菌株16S rDNA序列測定及其系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)每個遺傳型包含的菌株數(shù)量及其菌落形態(tài)特征，從9種酶切類型中選取15株代表菌進行16S rRNA基因序列的測定。將所得序列在EzTaxon server 2.1和GenBank中進行Blast比對分析。結(jié)果顯示，鶯歌海鹽場曬鹽池底泥可培養(yǎng)芽胞桿菌資源主要分布在芽胞桿菌科（Bacillaceae）和類芽胞桿菌科（Paenibacillaceae）。其中，Bacillaceae科下包含喜鹽芽胞桿菌屬（Halobacillus，33.3%）、芽胞桿菌屬（Bacillus，占13.3%）、海洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus，6.7%）3個屬；Paenibacillaceae科下有Pontibacillus屬（占46.7%），為可培養(yǎng)芽孢桿菌的優(yōu)勢屬，Halobacillus為次優(yōu)勢屬。

通過序列比對還發(fā)現(xiàn)，16S rDNA最大同源性在99.3%以上的有8株；同源性在98%～99%的有4株，分別是HB12542（98.0%）、HB12541（98.0%）、HB12547（98.1%）和HB12543（98.9%）；同源性在98%以下的有3株，分別是HB12536（97.7%）、HB12548（97.4%）和HB12569（97.8%）。這6株菌有可能代表著芽胞桿菌的新資源，為潛在的新分類單元。

各菌株間的系統(tǒng)進化關(guān)系見圖3所示。菌株HB12527與菌株HB12530屬于Pontibacillus屬，在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚為一簇，親緣關(guān)系較近；菌株HB12535與Pontibacillus yanchengensis聚于一簇，參考其16S rDNA的最大同源性數(shù)值（99.7%），推測HB12535可能為Pontibacillus yanchengensis；而HB12536、HB12542、HB12547和HB12569聚于系統(tǒng)發(fā)育樹上Pontibacillus屬的另一簇，同時其16S rDNA最大同源性為97.7%～98.1%，這4株菌可能代表著Pontibacillus屬新的分類單元。菌株HB12541與Halobacillus naozhouensis的序列相似性最高（98.0%），但在系統(tǒng)發(fā)育樹中處于一個相對獨立的分支，也可能是潛在的新種，有待于進一步進行多相分類以確定其最終歸屬地位。

3 討論與結(jié)論

高鹽環(huán)境微生物具有獨特的種群類型，它們具有特殊的生理機制及代謝產(chǎn)物類型，是一類極具開發(fā)潛力的生物資源。本文對鶯歌海鹽場30%鹽度曬鹽池底泥中可培養(yǎng)芽胞桿菌資源進行研究，從中分離到215株芽胞桿菌，序列分析結(jié)果表明，這些菌株分屬于Pontibacillus、Halobacillus、Oceanobacillus和Bacillus屬，存在較高的多樣性；此外，系統(tǒng)發(fā)育分析表明，鶯歌海高鹽環(huán)境不同種芽胞桿菌間的進化距離比較接近。

海洋（或沿海）高鹽環(huán)境中的微生物區(qū)系不同于內(nèi)陸高鹽環(huán)境[14]。肖煒[6]在研究昆明鹽礦古老巖鹽沉積中可培養(yǎng)細菌多樣性時發(fā)現(xiàn)，Bacillus為鹵水和鹽晶中的優(yōu)勢菌，各占總細菌分離量的26.1%和59.9%。馮二梅等[15]對煙臺海域中度嗜鹽菌進行了分離鑒定，結(jié)果表明這些菌分布于7個屬，其中芽胞桿菌有Bacillus、Virgibacillus、Gracilibacillus。在陸地高鹽環(huán)境的研究中，鄭賀云等[7]在研究新疆阿克蘇地區(qū)鹽堿地中細菌多樣性時得出，Bacillus為其中的主要類群。潘媛媛等[8]在松嫩平原鹽堿地中也發(fā)現(xiàn)了Bacillus和Oceanobacillus資源。對新疆不同地區(qū)高鹽環(huán)境中嗜鹽菌的研究結(jié)果表明，不同高鹽地區(qū)的嗜鹽菌在組成上具有一定的相似性：Bacillus和Halobacillus在這些地區(qū)均有分布，但在各地區(qū)的優(yōu)勢度不同[9-11]。本研究在鶯歌海30%鹽度曬鹽池底泥中也發(fā)現(xiàn)了Halobacillus、Oceanobacillus和Bacillus等嗜鹽芽胞桿菌資源，反映出不同高鹽環(huán)境芽胞桿菌資源在群落組成上具有一定的相似性。但是，本研究中Pontibacillus為優(yōu)勢屬，與陸地高鹽環(huán)境中的不同，這也證明了海洋高鹽環(huán)境中芽胞桿菌資源的獨特性。

本研究還發(fā)現(xiàn)了一些潛在的芽孢桿菌新種，鶯歌海高鹽環(huán)境曬鹽池底泥中分離的嗜鹽菌HB12536與模式菌種Pontibacillus yanchengensis的親緣關(guān)系最近（相似性為97.7%），是Pontibacillus屬的潛在新種。Pontibacillus yanchengensis是一株革蘭氏陽性、嚴格好氧的中度嗜鹽芽胞桿菌[16]。菌株HB12541與模式菌種Halobacillus naozhouensis的親緣關(guān)系最近（相似性為98.0%），而Halobacillus naozhouensis是一株革蘭氏陽性、具有過氧化氫酶活性、好氧的桿狀中度嗜鹽細菌[17]。中度嗜鹽細菌對環(huán)境的適應(yīng)能力極強，分布廣泛，能分泌耐高溫的胞外酶（淀粉酶、脂肪酶等）和多聚體，可應(yīng)用于食品工業(yè)、酶制劑和化妝品生產(chǎn)、石油回收、基因工程領(lǐng)域以及環(huán)境污染的生物修復(fù)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景[18]。由此可見，鶯歌海高鹽環(huán)境曬鹽池底泥中存在著較為豐富的芽孢桿菌資源，并且存在一些潛在的芽孢桿菌新種，有待進一步研究開發(fā)。

參考文獻

[1] 寧 華， 張榮先， 陳 浩， 等. 滇池中芽孢桿菌的ARDRA分類及溶藻特性[J]. 湖泊科學(xué)， 2008， 20（5）： 675-680.

[2] 龔國淑， 唐志燕， 鄧香潔， 等. 成都郊區(qū)土壤芽孢桿菌的空間分布及其多樣性[J]. 生態(tài)學(xué)雜志， 2009， 28（10）： 2009-2013.

[3] Sass A M， McKew B A， Sass H， et al. Diversity of Bacillus-like organisms isolated from deep-sea hypersaline anoxic sediments[J]. Saline systems， 2008， 4（8）： 1 746-1 448.

[4] Zhang S， Moyne A L， Reddy M S， et al. The role of salicylic acid in induced systemic resistance elicited by plant growth-promoting rhizobacteria against blue mold of tobacco[J]. Biological Control， 2002， 25（3）： 288-296.

[5] 楊少波， 劉訓(xùn)理. 多粘類芽孢桿菌及其產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)研究進展[J]. 微生物學(xué)通報， 2008， 35（10）： 1 621-1 625.

[6] 肖 煒， 楊亞玲， 劉宏偉， 等. 昆明鹽礦古老巖鹽沉積中可培養(yǎng)細菌多樣性研究[J]. 微生物學(xué)報， 2006， 46（6）： 967-972.

[7] 鄭賀云， 黎志坤， 李超， 等. 新疆阿克蘇地區(qū)鹽堿地細菌類群多樣性及優(yōu)勢菌群分析[J]. 微生物學(xué)通報， 2012， 39（7）： 1 031-1 043.

[8] 潘媛媛， 黃海鵬， 孟 婧， 等. 松嫩平原鹽堿地中耐（嗜）鹽菌的生物多樣性[J]. 微生物學(xué)報， 2012， 52（10）： 1187-1194.

[9] 羅 明， 韓 劍， 蔣平安， 等. 新疆羅布泊地區(qū)可培養(yǎng)嗜鹽細菌多樣性[J]. 生物多樣性， 2009， 17（3）： 288-295.

[10] 劉會強， 呂建江. 新疆達坂城鹽湖中度嗜鹽菌的16SrDNA序列研究[J]. 新疆師范大學(xué)學(xué)報： 自然科學(xué)版， 2009， 27（4）： 46-50.

[11] 顧曉穎， 李 冠， 吳 敏. 巴里坤湖和瑪納斯湖嗜鹽菌的分離及功能酶的篩選[J]. 生物技術(shù)， 2007， 17（3）： 27-30.

[12] Sass A M， McKew B A， Sass H， et al. Diversity of Bacillus-like organisms isolated from deep-sea hypersaline anoxic sediments[J]. Saline Systems， 2008， 4（8）： 1 746-1 448.

[13] Beneduzi A， Moreira F， Costa PB， et al. Diversity and plant growth promoting evaluation abilities of bacteria isolated from sugarcane cultivated in the South of Brazil[J]. Applied Soil Ecology， 2013， 63： 94-104.

[14] 任培根， 周培瑾. 中度嗜鹽菌的研究進展[J]. 微生物學(xué)報， 2003， 43（3）： 427-431.

[15] 馮二梅， 宿紅艷， 王 磊. 煙臺海域中度嗜鹽菌分離、 鑒定和系統(tǒng)進化研究[J]. 海洋通報， 2010， 29（1）： 52-58.

[16] Yang Y， Zou Z， He M， et al. Pontibacillus yanchengensis sp. nov.， a moderately halophilic bacterium isolated from salt field soil[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology， 2011， 61（8）： 1 906-1 911.

[17] Chen Y G， Liu Z X， Zhang Y Q， et al. Halobacillus naozhouensis sp. nov.， a moderately halophilic bacterium isolated from a sea anemone[J]. Antonie van Leeuwenhoek， 2009， 96（1）： 99-107.

[18] 趙百鎖， 楊禮富， 宋 蕾， 等. 中度嗜鹽菌在生物技術(shù)中的應(yīng)用[J]. 微生物學(xué)通報， 2007， 34（2）： 359-362.