中國橡膠樹苗圃2種炭疽病菌分子鑒定及分布分析

摘 要 根據(jù)膠孢炭疽菌和尖孢炭疽菌特異引物對，對采自中國云南、海南、廣東和廣西植膠區(qū)的138株炭疽病菌進(jìn)行分子鑒定。結(jié)果顯示：138株炭疽菌中鑒定為膠孢炭疽菌的有100株，占總測定株數(shù)的72.46%，尖孢炭疽菌的有38株，占總測定株數(shù)的27.54%。其中海南、云南和廣東橡膠苗圃中膠孢炭疽菌占所分析菌株總數(shù)比例分別為81.82%（54/66）、60.0%（15/25）和77.27%（17/22），而廣西3個(gè)橡膠苗圃中的2個(gè)苗圃地尖孢炭疽和膠孢炭疽病菌各占一半?？傮w來看，國內(nèi)橡膠樹苗圃地炭疽病病原菌仍以膠孢炭疽菌為主，部分苗圃同時(shí)存在膠孢和尖孢炭疽菌的危害。

關(guān)鍵詞 橡膠樹；膠孢炭疽；尖孢炭疽；種特異性PCR；分子鑒定

中圖分類號 S432.4 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract Based on the previous study， the Colletotrichum gloeosporioides-specific primers CgInt/ITS4， and the Colletotrichum acutatum-specific primers CaInt2/ITS4 and CAF53/CAR356 were used for taxon-speific amplification to characterize the Colletotrichum species of 138 isolates from Colletotrichum leaf disease lesions on Hevea brasiliensis on the rubber nurseries in China. The results revealed that only 38 isolates belonged to C. acutatum， and 100 isolates to C. gloeosporioides. The rates of C. gloeosporioides on the nurseries in Hainan， Yunnan， Guangdong and Guangxi provinces were 81.82%， 60.0%， 77.27% and 52%， respectively. On the whole， the results indicated that C. gloeosporioides was the dominant species responsible for Colletotrichum leaf disease on H. brasiliensis plants in China.

Key words Hevea brasiliensis； Colletotrichum gloeosporioides； Colletotrichum acutatum； Species-specific PCR； Molecular identification

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.09.024

炭疽菌（Colletotrichum spp.）是一類重要的植物病原真菌，廣泛分布于熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)，其寄主范圍十分廣泛，包括蔬菜、牧草、果樹、花卉等數(shù)十種重要經(jīng)濟(jì)作物。炭疽菌引起的橡膠樹炭疽病是橡膠樹的一種重要葉部病害，可危害苗圃小苗、大田幼樹直至成齡開割膠樹，侵染嫩葉、葉柄、嫩梢和果實(shí)等部位，引起嫩葉脫落、嫩梢回枯和果實(shí)腐爛，甚至形成僵果掛在樹上[1-2]。嚴(yán)重時(shí)會引起膠樹的重復(fù)落葉和嫩梢回枯，推遲開割時(shí)間[3]。該病于1905年在斯里蘭卡錫蘭首次發(fā)現(xiàn)[4]。橡膠樹炭疽病病原菌有膠孢炭疽菌（Collectotrichum gloeosporioides）和尖孢炭疽菌（Collectotrichum acutatum）2種。在植膠國中，多數(shù)認(rèn)為膠孢炭疽菌為主要病原菌，如巴西、馬來西亞、印度、印度尼西亞和泰國；部分國家報(bào)道是以尖孢炭疽菌為主要病原菌，如斯里蘭卡[5]。

在我國，橡膠樹炭疽病于1962年在海南國營大豐農(nóng)場首次發(fā)現(xiàn)。目前該病在我國普遍發(fā)生[6]，早期研究結(jié)果表明，在我國該病致病菌為膠孢炭疽菌[3，7]，2008年發(fā)現(xiàn)有尖孢炭疽菌為害[8]。研究結(jié)果表明，兩種炭疽菌在生物學(xué)特性、抗藥性和菌落形態(tài)上均存在較大差異[9-11]。但國內(nèi)植膠區(qū)炭疽病菌以哪個(gè)種為主，至今未見報(bào)道。筆者于2013年調(diào)查了我國橡膠樹主要苗圃炭疽病的發(fā)生情況，并采集樣品進(jìn)行室內(nèi)分離鑒定。本研究以所分離的138株炭疽菌為研究對象，依據(jù)膠孢和尖孢炭疽菌特異引物對，利用PCR方法，對炭疽病菌的種類和分布進(jìn)行分析，為該病防治策略的制定提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的138株炭疽菌為2013年筆者所在實(shí)驗(yàn)室從國內(nèi)橡膠主栽區(qū)收集的病樣中按照組織分離法進(jìn)行分離獲得，并用柯赫氏法則進(jìn)行了致病性鑒定。各菌株及癥狀描述詳見表1。

1.2 方法

1.2.1 菌株形態(tài)觀察 將各菌株分別接種于PDA平板上，置于28 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5～7 d觀察記錄菌落顏色、氣生菌絲濃密或稀疏等情況。

1.2.2 分子鑒定

（1）菌絲收集和基因組DNA提取。炭疽菌培養(yǎng)參考林春花等[17]的方法。采用高通量樣品組織研磨儀（TissuelyserⅡ，QIAGENR）小量提取待測菌株的基因組DNA，用蓋玻片將平板上的菌絲刮下放入樣品管中，每個(gè)樣品管放入2顆研磨珠，加入800 μL CTAB提取液，將樣品管放在適配器上（每個(gè)適配器最多可放96個(gè)樣品），再將適配器擰緊到研磨儀活塞上，設(shè)置破碎時(shí)間5 min，2～3次。破碎完成后取出溶液，采用常規(guī)方法，用氯仿 ∶ 異戊醇（24 ∶ 1）抽提兩次，取上清，用無水乙醇沉淀基因組DNA。

（2）特異引物及PCR檢測。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，膠孢炭疽菌鑒定引物對為CgInt/ITS4（CgInt：5′-GGCC

TCCCGCCTCCGGGCGG-3′、ITS4：5′-TCCTCCGCT

TATTGATATGC-3′）[13-14]，能擴(kuò)增獲得1條約450 bp的特異片段；尖孢炭疽菌鑒定引物對為CaInt2/ITS4（CaInt2：5′-GGGGAAGCCTCTCGCGG-3′、ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）和CAF53/CAR356（CAF53：5′-GGGCAGGGGAAGCCTCTCG-3′、CAR356：5′-AGCGGTGCTTGAGGGTTG-3′），能分別擴(kuò)增獲得1條約490 bp和303 bp的特異片段[15]。

PCR反應(yīng)體系：10×Buffer 2.5 μL， 10 μmol/L 引物一0.5 μL，10 μmol/L 引物二0.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，模板DNA 0.5 ng，0.5 U/μL Taq酶0.2 μL，加ddH2O至總體積25 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min，10 ℃ 保存，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測分析，觀察記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株形態(tài)觀察

本研究對2013年分離自我國橡膠主產(chǎn)區(qū)苗圃的138株炭疽菌（海南66株、云南25株、廣西25株和廣東22株）進(jìn)行菌落形態(tài)觀察。結(jié)果詳見表1。

2.2 分子鑒定

利用特異性引物對CgInt/ITS4、CaInt2/ITS4和CAF53/CAR356分別對138株炭疽菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將引物對CgInt/ITS4能擴(kuò)增獲得特異片段，而引物對CaInt2/ITS4和CAF53/CAR356擴(kuò)增不出特異性片段的菌株鑒定為膠孢炭疽菌；反之則鑒定為尖孢炭疽菌（圖1和表1）。根據(jù)鑒定結(jié)果，138株炭疽菌中鑒定為膠孢炭疽菌的有100株，占總測定株數(shù)的72.46%；尖孢炭疽菌的有38株，占總測定株數(shù)的27.54%。據(jù)此可以推測，國內(nèi)主要橡膠樹苗圃中以膠孢炭疽菌為優(yōu)勢種。

海南38個(gè)苗圃地中采集到的66株炭疽菌中，膠孢炭疽菌占81.82%（54/66），尖孢炭疽菌占18.18%（12/66）；其中的34個(gè)（占89.47%）苗圃發(fā)現(xiàn)有膠孢炭疽菌為害，11個(gè)（占28.75%）苗圃有尖孢炭疽菌危害，且樂東大安、白沙邦溪民營膠園、儋州兩院五隊(duì)、屯昌中建農(nóng)場、瓊海東紅農(nóng)場苗圃2、瓊海東紅農(nóng)場苗圃3、萬寧東興農(nóng)場、陵水什玲鎮(zhèn)什也村8個(gè)橡膠苗圃同時(shí)存在尖孢和膠孢炭疽菌的危害。

云南16個(gè)苗圃中，膠孢炭疽菌占64.0%（16/25），尖孢炭疽菌占36.0%（9/25）。其中的11個(gè)（占68.75%）苗圃發(fā)現(xiàn)有膠孢炭疽菌危害，8個(gè)苗圃（占50.00%）有尖孢炭疽菌危害，3個(gè)苗圃地同時(shí)存在尖孢和膠孢炭疽菌的為害。說明云南橡膠苗圃與海南橡膠苗圃一樣，以膠孢炭疽菌為優(yōu)勢種，但其尖孢炭疽菌為害比例要比海南的高。

廣東5個(gè)苗圃中，膠孢炭疽菌占77.27%（17/22），尖孢炭疽菌占22.73%（5/22）。除了“廣東農(nóng)墾亞熱帶作物研究所”樣品僅檢測到膠孢炭疽菌外，其他4個(gè)苗圃地既檢測到膠孢炭疽菌，也檢測到尖孢炭疽菌。其中，在“湛江市南亞所2”苗圃地的一片病葉上既分離到膠孢炭疽菌也分離到尖孢炭疽菌。

根據(jù)病樣癥狀類型差異，本研究在廣西東興農(nóng)場3個(gè)苗圃地采集分離獲得25株炭疽菌，其中膠孢炭疽菌占52%（13/25），尖孢炭疽菌占48%（12/25）；東興農(nóng)場2苗圃中分離到5個(gè)炭疽菌，其中膠孢炭疽有3株，尖孢炭疽為2株；另外兩個(gè)苗圃地炭疽菌的膠孢炭疽和尖孢炭疽數(shù)量相同，各占50%。說明在廣西東興農(nóng)場的橡膠苗圃中，炭疽菌的種群結(jié)構(gòu)由尖孢炭疽菌和膠孢炭疽菌按均等比例構(gòu)成。

3 討論與結(jié)論

炭疽病是普遍存在的植物病害，引起炭疽病的病原菌為炭疽菌屬真菌，炭疽菌屬下的種很多，2009年Hyde等在研究和整理文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，列出了66個(gè)合格的分類單元，還指出存在爭議的19個(gè)種[16]。傳統(tǒng)的炭疽屬分類，是以形態(tài)學(xué)以及寄主范圍分類為主。種的分類主要以分生孢子形態(tài)、附著胞形態(tài)、剛毛的有無、分生孢子梗和產(chǎn)孢細(xì)胞的形態(tài)大小，菌核、厚垣孢子的有無及形態(tài)等作為分類依據(jù)[17]。但由于炭疽菌種間形態(tài)特征差異微小和不穩(wěn)定，該屬中種的分類不統(tǒng)一。相對于形態(tài)學(xué)分類，分子分類能夠反映物種間核苷酸序列最本質(zhì)的差異，分類性狀穩(wěn)定而標(biāo)準(zhǔn)[18]。近年來，基于分子標(biāo)記的系統(tǒng)學(xué)方法被廣泛應(yīng)用于該屬真菌的分類。目前，已確定引起橡膠樹炭疽病的病原菌有兩種，分別為膠孢炭疽菌和尖孢炭疽菌。據(jù)報(bào)道，通過孢子形態(tài)、有性態(tài)有無、生長速率和菌落顏色可區(qū)分尖孢炭疽菌和膠孢炭疽菌[19-21]。但是對于無長期分類經(jīng)驗(yàn)的學(xué)者來說，采用形態(tài)學(xué)方法對二者進(jìn)行區(qū)分，在實(shí)踐過程中常常無法準(zhǔn)確鑒定。本研究根據(jù)前人工作基礎(chǔ)，利用特異性引物對二者進(jìn)行鑒定，方法準(zhǔn)確、快速。

炭疽病是我國植膠區(qū)普遍發(fā)生的一種葉部病害。炭疽病菌存在較為豐富的遺傳變異，且隨著主栽品種的改變以及氣候條件的變化，橡膠樹炭疽病病原菌種群可能發(fā)生改變。本研究對我國海南、廣東、廣西和云南部分植膠區(qū)橡膠樹炭疽病菌的種進(jìn)行鑒定，每個(gè)苗圃采集多個(gè)樣品，且對癥狀表現(xiàn)不同的樣品均進(jìn)行分離鑒定，其結(jié)果基本反應(yīng)了我國橡膠樹炭疽菌病原菌種類和分布的基本情況。云南省是我國橡膠種植主要種植地，本研究所收集的病樣只覆蓋云南省部分地區(qū)，其結(jié)果可能不能完全代表云南省橡膠樹炭疽病病原菌分布情況，但也基本說明了所調(diào)查地的情況。廣西橡膠種植地主要集中在東興市，本研究對其3個(gè)苗圃地詳細(xì)分析了炭疽病菌的種，顯示主要病原菌為膠孢和尖孢炭疽菌兩種。在海南、廣東和云南省也顯示部分苗圃地以尖孢炭疽菌為主。膠孢炭疽菌和尖孢炭疽菌的抗藥性不同[11]，所使用的防治藥劑有所區(qū)別，本研究結(jié)果可為生產(chǎn)上科學(xué)合理用藥提供參考依據(jù)。

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