海南普通野生稻OrNAC5的克隆和表達(dá)分析

徐靖等

摘 要 根據(jù)EST序列信息，從海南普通野生稻中克隆了一個(gè)NAC（NAM， ATAF and CUC）類轉(zhuǎn)錄因子OrNAC5。該基因編碼區(qū)cDNA長(zhǎng)度699 bp，編碼232個(gè)氨基酸，對(duì)應(yīng)的DNA長(zhǎng)度為2 538 bp，含有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子。推導(dǎo)的OrNAC5氨基酸序列具有典型的NAC類轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)特征，與水稻（Oryza sativa）、短花藥野生稻（Oryza brachyantha）、大麥（Hordeum vulgare）、谷子（Setaria italica）中相應(yīng)蛋白的同源性分別為99%、81%、60%和58%。對(duì)OrNAC5啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)存在多種激素應(yīng)答和脅迫響應(yīng)的調(diào)控元件。Real-Time PCR結(jié)果顯示，低溫、干旱和鹽脅迫均能誘導(dǎo)OrNAC5的表達(dá)。上述結(jié)果表明OrNAC5可能在逆境響應(yīng)過程中具有重要功能。

關(guān)鍵詞 普通野生稻；OrNAC5；逆境；基因表達(dá)

中圖分類號(hào) S511.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Bast on EST sequences， a gene named OrNAC5 conding NAC（NAM， ATAF and CUC）transcription factor was cloned from wild rice（Oryza rufipogon）in Hainan. The cDNA length was 699 bp and DNA length was 2 538 bp， containing three exons and two introns. The deduced OrNAC5 had the typical structure of NAC transcription factor， and showed high identities of 99%， 81%， 60% and 58% to those of NAC transcription factors from Oryza sativa， Oryza brachyantha， Hordeum vulgare and Setaria italica. Elements related to stress signals and hormone were found in putative promoter region of OrNAC5. Real-Time PCR results showed that OrNAC5 was induced by drought， salt stress and low temperature stress. All these data suggest that OrNAC5 may play important roles in regulating stress response.

Key words Oryza rufipogon； OrNAC5； Stress； Gene expression

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.09.016

干旱、低溫和高鹽等非生物脅迫嚴(yán)重影響了農(nóng)作物的生長(zhǎng)發(fā)育和作物產(chǎn)量[1-2]。植物已在分子、細(xì)胞和系統(tǒng)水平上進(jìn)化出了一套復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)來感受并響應(yīng)各種外界刺激，轉(zhuǎn)錄因子在這一過程中扮演重要的調(diào)控作用[3]。NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，含有一個(gè)大約150個(gè)氨基酸組成的高度保守的NAC結(jié)構(gòu)域，廣泛參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育、激素調(diào)節(jié)和脅迫響應(yīng)[3-4]。NAC轉(zhuǎn)錄因子在擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）、大豆（Glycine max）、小麥（Triticum aestivum）等[4-7]植物中廣泛存在且數(shù)量眾多，擬南芥含有110個(gè)成員，水稻中則多達(dá)140個(gè)，但植物中只有少部分NAC轉(zhuǎn)錄因子的功能得到鑒定。最近，越來越多的研究證實(shí)NAC轉(zhuǎn)錄因子在響應(yīng)干旱、低溫和高鹽等非生物脅迫過程中具有重要功能[8-10]。

普通野生稻（Oryza rufipogon）是栽培稻的祖先，能夠長(zhǎng)期生長(zhǎng)在各種惡劣的自然條件下，具有很強(qiáng)的抗逆特性，是水稻抗逆育種重要的遺傳資源[11]。海南普通野生稻最原始，遺傳多樣性最高，具有很高的開發(fā)利用價(jià)值[12-13]。在先前的研究中，篩選獲得一批抗逆性較強(qiáng)的海南普通野生稻材料，能夠長(zhǎng)期在干旱、低溫和貧瘠等條件下健康生長(zhǎng)。為了進(jìn)一步了解海南普通野生稻的抗旱機(jī)理，筆者對(duì)干旱條件下差異表達(dá)基因進(jìn)行了分析，并篩選獲得了1條與水稻中NAC轉(zhuǎn)錄因子基因ONAC005（GenBank登錄號(hào)AK104766）同源性有99%的基因片段。本文在此基礎(chǔ)上對(duì)該基因進(jìn)行克隆和表達(dá)分析，為揭示該基因在脅迫響應(yīng)中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

將在海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院野生稻異位保存圃中收集的普通野生稻（Oryza rufipogon）種子，置于50 ℃烘箱中干燥48 h，打破休眠，用1%的HgCl2消毒10 min，清水沖洗4～5次。置于28 ℃人工氣候箱培養(yǎng)（8 h光照/16 h黑暗），使用國(guó)際水稻所營(yíng)養(yǎng)液[14]進(jìn)行培養(yǎng)，每5 d換1次培養(yǎng)液，長(zhǎng)至3葉期時(shí)于含有20% PEG的營(yíng)養(yǎng)液中進(jìn)行模擬干旱處理，含有150 mmol/L NaCl的營(yíng)養(yǎng)液中進(jìn)行鹽脅迫處理，4 ℃光照培養(yǎng)箱中（8 h光照/16 h黑暗）低溫處理，分別在處理0、2、4、6、12、24、48 h取樣，用液氮磨成干粉狀，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 核酸提取及cDNA合成 普通野生稻葉片總RNA和基因組DNA的提取分別采用成都福際生物技術(shù)有限公司的植物總RNA提取試劑盒（RE-05011）和植物DNA提取試劑盒（DE-06111）進(jìn)行，具體參見說明書。cDNA第一條鏈合成采用北京全式金生物技術(shù)有限公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒（AT301-02），具體步驟參見說明書。

1.2.2 OrNAC5基因和啟動(dòng)子的克隆 根據(jù)先前篩選獲得的NAC轉(zhuǎn)錄因子基因片段，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索到與它最相似基因的cDNA序列，設(shè)計(jì)特異引物OsNAC1F：5′-TTGATACGATGGAGAGGG

CGGC-3′和OsNAC1R：5′-GATCGGTTTAATTAGTC

TGTT-3′。根據(jù)OrNAC5在水稻基因組中最相似基因的啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)特異性引物PNAC1F：5′-CAG

ACAGATTGGCGAACCGGA-3′和PNAC1R：5′-GAA

GTACTTGTCCCCGTCGCT-3′，分別以海南普通野生稻cDNA和基因組DNA為模板，對(duì)OrNAC5的cDNA序列和啟動(dòng)子序列進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收和純化后，與pMD-18T Cloning Kit（TAKARA公司）連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)至DH5a感受態(tài)細(xì)胞，通過PCR檢測(cè)確定陽(yáng)性克隆，送北京諾賽基因組研究中心有限公司測(cè)序。

1.2.3 OrNAC5生物學(xué)信息學(xué)分析 用ORF finder分析OrNAC5 cDNA序列的開放閱讀框，蛋白質(zhì)序列分析在http：//www.expasy.org網(wǎng)站相關(guān)軟件完成；利用在線軟件GSDS對(duì)基因的外顯子/內(nèi)含子進(jìn)行界定；通過BLAST（網(wǎng)址：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）與GenBank中登記的序列進(jìn)行同源性比較，用DNAMAN軟件對(duì)氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；利用啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)網(wǎng)站PLACE軟件（http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan. html）對(duì)OrNAC5啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析。

1.2.4 OrNAC5的表達(dá)分析 采用康為世紀(jì)公司的SYBR Green RT-PCR One Step Kit及Mx3005P PCR儀進(jìn)行PCR產(chǎn)物實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)基因表達(dá)水平。目的基因引物為QNAC1F：5′-GGGTCATGCACGAGT

ACAG-3′和QNAC1R：5′-GCTGCTGCTCCTCTGAA

ATA-3′；內(nèi)參引物為18S，其引物為18SF：5′-CG

TCCCTGCCCTTTGTACAC-3′和18SR：5′-CGAACA

CTTCACCGGATCATT-3′。PCR程序：95 ℃預(yù)變性 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。按默認(rèn)程序繪制55 ℃至95 ℃融解曲線，并把 0 h的樣品設(shè)為Calibrator，進(jìn)行相對(duì)表達(dá)定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 OrNAC5基因克隆和分子特征

先前的研究中，在海南普通野生稻中獲得一條編碼NAC轉(zhuǎn)錄因子的EST序列，本研究在此基礎(chǔ)上對(duì)其編碼區(qū)cDNA序列和基因組序列進(jìn)行了克隆，將獲得的基因命名為OrNAC5（GenBank登錄號(hào)KJ690249）。OrNAC5編碼區(qū)cDNA長(zhǎng)度為699 bp，對(duì)應(yīng)的DNA長(zhǎng)度為2 538 bp，編碼232個(gè)氨基酸。編碼蛋白的分子量為24.70 ku，理論等電點(diǎn)為9.87。利用在線軟件GSDS，對(duì)OrNAC5的基因cDNA和DNA序列進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)，OrNAC5的基因組包含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子（圖1），外顯子和內(nèi)含子的剪接均符合GT-AG原則。

生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，OrNAC5具有典型的植物NAC類轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)特征，包含一個(gè)由138個(gè)氨基酸組成的NAC保守結(jié)構(gòu)域（圖2）。OrNAC5與水稻ONAC005（BAG96939）同源性為99%，涉及3個(gè)氨基酸的變異；與短花藥野生稻（Oryza brachyantha，XP_006659635）、大麥（Hordeum vulgare，CBZ41165）、谷子（Setaria italica XP_004974022）中相應(yīng)蛋白的同源性分別為81%、60%和58%。

2.2 OrNAC5啟動(dòng)子的克隆和序列分析

通過PCR擴(kuò)增和序列比對(duì)，獲得OrNAC5翻譯起始密碼子ATG上游1 341 bp的啟動(dòng)子序列，該序列和ONAC005相對(duì)應(yīng)啟動(dòng)子區(qū)的同源性為97%（圖3）。對(duì)OrNAC5啟動(dòng)子序列進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)該序列具有真核生物典型啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)特征，含有多個(gè)真核生物啟動(dòng)子基本元件，如啟動(dòng)子核心元件 TATA-box，增強(qiáng)子元件CAAT-box和GATA-box等；核心啟動(dòng)子區(qū)位于ATG上游-227～ -184 bp，其可能的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于翻譯起始位點(diǎn)上游-193 bp處；OrNAC5啟動(dòng)子區(qū)還含有眾多應(yīng)答激素和脅迫信號(hào)元件，如茉莉酸應(yīng)答元件CGTCA-motif、生長(zhǎng)素應(yīng)答元件TGA-element、赤霉素應(yīng)答元件P-box和GARE-motif、厭氧應(yīng)答元件ARE、高溫應(yīng)答元件HSE、干旱應(yīng)答元件MBS以及防御和脅迫響應(yīng)元件TC-rich repeats等；此外，還含有與分裂組織表達(dá)相關(guān)元件CAT-box、胚乳表達(dá)相關(guān)元件Skn-1_motif和幼苗特異表達(dá)元件as-2-box 等。這說明OrNAC5可能廣泛參與生長(zhǎng)發(fā)育、激素應(yīng)答和脅迫響應(yīng)等過程。

2.3 OrNAC5的表達(dá)分析

熒光定量PCR結(jié)果顯示，PEG模擬干旱、鹽和低溫處理均能顯著上調(diào)OrNAC5的表達(dá)。PEG處理后，OrNAC5的表達(dá)量在24 h 達(dá)到最大值（圖4-A）；OrNAC5的表達(dá)在鹽處理后早期變化并不明顯，直到48 h后顯著增加達(dá)到最大值（圖4-B）；OrNAC5對(duì)低溫比較敏感，處理后2 h OrNAC5的表達(dá)量顯著上調(diào)，6 h時(shí)達(dá)到最大值，48 h時(shí)仍維持較高水平（圖4-C）。

3 討論與結(jié)論

大量研究證實(shí)NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物響應(yīng)生物和非生物脅迫過程中發(fā)揮重要作用[8-10]。例如，在擬南芥中AtNAC019、AtNAC055和AtNAC072能夠激活下游鹽和干旱脅迫基因的表達(dá)來增強(qiáng)植株抗旱性[15]；AtNAC2參與多種激素和鹽脅迫響應(yīng)，并與側(cè)根的發(fā)育有關(guān)[16]；ATAF1和ATAF2在干旱和病菌響應(yīng)過程中具有重要作用[17]。在棉花中6個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子基因被克隆鑒定，它們的表達(dá)受到干旱、高鹽、冷害等多種非生物脅迫的誘導(dǎo)。在水稻中也有多個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子功能得到鑒定，通過表達(dá)OsNAC1、OsNAC5、OsNAC6、OsNAC045、OsNAC052和OsNAC063基因后能夠增強(qiáng)植株對(duì)干旱和多種非生物脅迫的耐受性[18-24]。雖然大量的NAC基因在不同植物中得到克隆，但只有小部分基因的功能得到鑒定。

海南普通野生稻能夠長(zhǎng)期在干旱、低溫和貧瘠等條件下健康生長(zhǎng)，具有較強(qiáng)的抗逆性。本研究在海南普通野生稻中篩選獲得一個(gè)受干旱誘導(dǎo)表達(dá)的NAC轉(zhuǎn)錄因子OrNAC5，該基因編碼的蛋白有232個(gè)氨基酸組成，初步確定該基因是一個(gè)多逆境應(yīng)答基因。OrNAC5除了受到干旱的誘導(dǎo)外，也能對(duì)低溫和鹽脅迫做出響應(yīng)。植物基因啟動(dòng)子含有多種重要的順式作用元件，在轉(zhuǎn)錄水平上通過與轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)調(diào)作用，參與調(diào)控下游基因的表達(dá)，從而使植物能夠?qū)Ω鞣N生物和非生物脅迫做出響應(yīng)[25]。OrNAC5啟動(dòng)子區(qū)含有厭氧應(yīng)答元件ARE、高溫應(yīng)答元件HSE、干旱應(yīng)答元件MBS以及防御和脅迫響應(yīng)元件TC-rich repeats等生物和非生物脅迫元件。進(jìn)一步說明OrNAC5在野生稻的逆境脅迫響應(yīng)中扮演重要角色。

普通野生稻馴化成栽培稻的過程中，一些基因會(huì)發(fā)生變異甚至丟失，這可能是普通野生稻具有更強(qiáng)的抗逆性的原因。OrNAC5在栽培稻中的同源基因ONAC005是一個(gè)功能未知基因，OrNAC5和ONAC005的編碼蛋白有3個(gè)氨基酸的差異，更大的差異在于啟動(dòng)子區(qū)域，所以有必要對(duì)OrNAC5的功能進(jìn)行繼續(xù)研究，下一步將構(gòu)建該基因的植物表達(dá)載體，通過轉(zhuǎn)化水稻和擬南芥植物對(duì)其功能做進(jìn)一步驗(yàn)證。

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