七葉蓮揮發(fā)油的GC/MS分析和抗炎鎮(zhèn)痛作用研究

章立華 劉力 林小鳳等

摘要[目的]研究福建七葉蓮揮發(fā)油的化學(xué)成分，探討七葉蓮揮發(fā)油的抗炎鎮(zhèn)痛作用。[方法]采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對七葉蓮揮發(fā)油的化學(xué)成分進(jìn)行了分析，結(jié)合計(jì)算機(jī)檢索技術(shù)對分離的化合物進(jìn)行鑒定，應(yīng)用面積歸一法計(jì)算各成分的相對含量，采用醋酸扭體法、小鼠耳二甲苯致炎腫脹法評價(jià)七葉蓮揮發(fā)油的抗炎鎮(zhèn)痛效果。[結(jié)果]從七葉蓮部分揮發(fā)油中共分離出61種成分，并鑒定確認(rèn)了其中53種主要成分，其中主要化合物和含量分別為4萜品醇20.40%、（-）-斯巴醇16.01%、氧化石竹烯8.90%等；七葉蓮揮發(fā)油可明顯減少小鼠醋酸所致的扭體次數(shù)，可明顯緩解小鼠二甲苯所致的耳廓腫脹。[結(jié)論]福建七葉蓮揮發(fā)油中主要含萜品烯、醇類化合物，且其揮發(fā)油具有明顯抗炎鎮(zhèn)痛作用。

關(guān)鍵詞七葉蓮；揮發(fā)油；氣相色譜-質(zhì)譜法；抗炎鎮(zhèn)痛作用

中圖分類號S567文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2014）23-07732-04

基金項(xiàng)目新疆醫(yī)科大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新基金（CX2014035，XJC2011117）。

作者簡介章立華（1987- ），男，江西南昌人，碩士研究生，研究方向：天然藥物的開發(fā)。*通訊作者，副教授，碩士，從事天然藥物化學(xué)研究。

收稿日期20140707七葉蓮（Schefflera arboricola Hayata），五加科鵝掌柴屬植物七葉蓮，別名小葉鴨腳木、漢桃葉、七葉爛、七葉藤、七加皮、狗腳蹄、沒骨消等，產(chǎn)于福建、臺灣、廣東等地，全年可采，以根、莖、葉入藥[1]。本品性苦味甘、祛風(fēng)除濕、活血止痛，對三叉神經(jīng)痛、偏頭痛、各種癌癥及手術(shù)后的疼痛均有良好的療效?！吨袊幍洹罚ㄒ徊浚?977年版對七葉蓮有收載。近年來，一些學(xué)者對其藥理作用、植物化學(xué)成分開展了大量研究[2-3]，目前相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道七葉蓮中含有三萜皂苷、揮發(fā)油、油脂、黃酮及苷等[4] 。藥理研究表明該植物對中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)有較強(qiáng)作用，此外還具有抗腫瘤、抑制平滑肌收縮等作用[5-6]。筆者采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[7-8]測定福建七葉蓮揮發(fā)油的化學(xué)成分，采用醋酸扭體法、小鼠耳二甲苯致炎腫脹法[9] 評價(jià)七葉蓮揮發(fā)油的抗炎鎮(zhèn)痛作用，為進(jìn)一步研究七葉蓮揮發(fā)油的藥理作用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象。試驗(yàn)所用的七葉蓮采自泉州市清源山，經(jīng)華僑大學(xué)分子藥物學(xué)研究院副教授劉建福鑒定為七葉蓮（Schefflera arboricola Hayata）的莖、葉。

1.1.2主要儀器。GC/MS 聯(lián)用儀，TURBOMASSAUTOSYSTEM XL型（PE公司）；電子天平，AB135S（Mettler Toledo公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，RE5298A（上海亞榮生化儀器廠）；循環(huán)水式多用真空泵，SHBⅢS（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；三用恒溫水箱，HHW600（江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠）。

1.1.3主要試劑。二甲苯（批號20100126，沈陽市新化試劑廠生產(chǎn)）；角叉菜膠（批號G1013-05G，Sigma 公司產(chǎn)品）；吲哚美辛（批號840643，上海第十七制藥廠）；醋酸地塞米松（批號091105，浙江仙琚制藥股份有限公司）；其余試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1七葉蓮葉揮發(fā)油提取與分離。 取新鮮七葉蓮葉15 kg，水蒸汽蒸餾取餾出液，用乙醚萃取3 次，合并乙醚萃取液，減壓蒸餾回收乙醚，用無水硫酸鈉干燥24 h 后，過濾，得到具有特殊氣味的無色揮發(fā)油5.97 g。

1.2.2GC/MS 聯(lián)用儀條件。

1.2.2.1色譜條件。Supelcowax10 彈性石英毛細(xì)管柱，色譜柱長60 m，內(nèi)徑0.25 mm，分流進(jìn)樣，分流比60∶1，進(jìn)樣量0.25 μl，載氣氦氣（99.999%），載氣流速16 psi，流量1.09 ml/min。進(jìn)樣口溫度240 ℃，初始柱溫65 ℃，以3.3 ℃/min的速率升至230 ℃，并保持10 min。

1.2.2.2質(zhì)譜條件。電離方式為EI，功率70 eV，光電倍增270 V，質(zhì)量掃描范圍35～500 u，掃描間隔0.2 s，電子能量70 eV；離子源200 ℃，接口溫度220 ℃，進(jìn)樣量0.2 μl。工作站名稱Turbmass 4.1，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫NIST98，WILEY庫。

1.2.3揮發(fā)油的成分鑒定。用GCMS聯(lián)用儀進(jìn)行全掃描分析；用化學(xué)工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)檢NIST98圖譜庫進(jìn)行譜圖解析并確認(rèn)揮發(fā)油中各成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)；利用該儀器所配的NIST98和Wiley7譜庫進(jìn)行自動(dòng)檢索，在對所得的譜圖進(jìn)行人工核對和補(bǔ)充檢索，用面積歸一法測得各組分的百分含量。

1.2.4小鼠足趾測定裝置。根據(jù)毛細(xì)管放大法，用導(dǎo)管、活塞和移液管等自制而成。清潔級昆明種小鼠，雌雄兼用，體重20～22 g，購自福州市吳氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號2007000516322。喂食鼠顆粒飼料和自來水，給藥前禁食12 h。

1.2.5醋酸扭體法鎮(zhèn)痛試驗(yàn)。小鼠50只，雌雄各半，隨機(jī)分成5 組。陰性對照組給予2% 吐溫80溶液10 ml/kg，連續(xù)灌胃5 d；陽性對照組給予吲哚美辛溶液0.4 mg/kg，第4 天開始灌胃給藥；樣品組給予相應(yīng)藥物，連續(xù)灌胃5 d。末次給藥后0.5 h，腹腔注射0.6% 醋酸溶液0.2 ml，用相機(jī)錄像（常規(guī)方法上改進(jìn)，保證記錄時(shí)間的平行性），觀察并記錄小鼠15 min 的扭體反應(yīng)次數(shù)，并計(jì)算扭體抑制率。

1.2.6對二甲苯誘發(fā)小鼠耳腫脹試驗(yàn)。雄性小鼠50只，隨機(jī)分5組。陰性對照組給予2% 吐溫80 溶液10 ml/kg，連續(xù)灌胃給藥5 d；陽性對照組給予地塞米松溶液0.4 mg/kg，第4 天開始灌胃給藥；樣品組連續(xù)灌胃5 d。末次給藥后0.5 h，小鼠左耳正反面各注射二甲苯于10 μl 致炎，15 min 后脫臼致死，用直徑為8 mm 的打孔器沿左右耳片同一部位打下圓耳片，稱重，左右耳的重量差作為腫脹度，比較組間差異顯著性。其中，腫脹抑制率（%）=（對照組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度）/對照組平均腫脹度×100%。

2結(jié)果與分析

2.1七葉蓮揮發(fā)油化學(xué)成分分析對七葉蓮揮發(fā)油氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析，得出七葉蓮揮發(fā)油成分GCMS總離子圖（）。從可以看出，各化合物分離效果較好，基線穩(wěn)定，雜峰小和無拖尾峰，共分離出61種化合物。各色譜峰相應(yīng)的質(zhì)譜圖經(jīng)人工解析及計(jì)算機(jī)檢索，確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)，共鑒定出53 種化合物，并用面積歸一化法測定出相對含量（）。由可見，從七葉蓮揮發(fā)油中共分離出61種化合物，53種化合物已經(jīng)鑒別出，其中4-萜品醇含量最高，占20.40%；其次是（-）-斯巴醇，占16.01%；氧化石竹烯占8.90%；里那醇占5.23%；其他化合物均低于5%。

2.2七葉蓮揮發(fā)油的抗炎鎮(zhèn)痛作用

2.2.1醋酸扭體法鎮(zhèn)痛試驗(yàn)。按“1.2.5”試驗(yàn)方法操作，結(jié)果表明（），與陰性對照比較，揮發(fā)油16 mg/kg 組可明顯減少小鼠的扭體次數(shù)（P<0.01），說明七葉蓮揮發(fā)油具有一定的抗炎鎮(zhèn)痛作用。

2.2.2對二甲苯誘發(fā)小鼠耳腫脹的影響。按“1.2.6”試驗(yàn)方法操作，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（），與陰性對照比較，揮發(fā)油16、8和4 mg/kg 組對二甲苯所致的急性炎癥均有明顯的抑制作用（P<0.01），且優(yōu)于陽性對照組。說明七葉蓮揮發(fā)油具有一定的抗炎鎮(zhèn)痛作用。安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2014年

七葉蓮葉揮發(fā)油對醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)的影響組別劑量∥mg/kg扭體次數(shù)∥次抑制率∥%陰性對照-55.6 ± 2.20陽性對照0.428.3 ± 4.8*49.1揮發(fā)油1627.0 ± 4.2*51.4揮發(fā)油840.1 ± 3.527.9揮發(fā)油442.8 ± 3.723.0注：*表示與陰性對照比較差異顯著（P<0.01）。

七

3結(jié)論與討論

采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對七葉蓮揮發(fā)油的化學(xué)成分進(jìn)行了分析，結(jié)合計(jì)算機(jī)檢索技術(shù)對分離的化合物進(jìn)行鑒定，應(yīng)用面積歸一法計(jì)算各成分的相對含量，采用醋酸扭體法、小鼠耳二甲苯致炎腫脹法評價(jià)七葉蓮揮發(fā)油的抗炎鎮(zhèn)痛效果。結(jié)果表明，從七葉蓮揮發(fā)油中共分離出61種成分，并鑒定確認(rèn)了其中53種主要成分，其中主要化合物和含量分別為4-萜品醇20.40%、（-）-斯巴醇16.01%、氧化石竹烯8.90%等；七葉蓮揮發(fā)油可明顯減少小鼠醋酸所致的扭體次數(shù)，可明顯緩解小鼠二甲苯所致的耳廓腫脹?？梢?，福建七葉蓮揮發(fā)油中主要含萜品烯、醇類化合物，且其揮發(fā)油具有明顯抗炎鎮(zhèn)痛作用。

參考文獻(xiàn)

[1] 南京藥學(xué)院《中草藥學(xué)》編寫組.中草藥學(xué)（中冊） [M].南京：江蘇人民出版社，1976：742.

[2] MELEKA F R，MIYASEB T，ABDEL KHALIKC S M，et al.Triterpenoid saponins from Schefflera arboricola [J].Phytochemistry，2003，63：401-407.

[3] 王立業(yè)，賈強(qiáng)，閻璽慶，等.紫外分光光度法測定七葉蓮中總皂苷的含量[J].中國藥房，2008，19（15）：1175.

[4] 張慧，章立華，黃玉香，等.七葉蓮化學(xué)成分的系統(tǒng)試驗(yàn)研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2014，25（1）：78-80.

[5] 陳蕾，朱霽虹，林瑞超.鵝掌柴屬植物化學(xué)成分及生理活性研究概況[J].中藥材，2002，25（5）：363-366.

[6] 劉睿，顧謙群，崔承彬，等.密脈鵝掌柴的化學(xué)成分及其抗腫瘤活性[J].中草藥，2005，36（3）：328-332.

[7] 張彥麗，韓艷春，阿依吐倫 · 斯馬義.GC-MS 對昆侖雪菊揮發(fā)油成分的研究[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，33（11）：1299-1300.

[8] 努爾阿尼也·熱合曼，熱娜·卡斯木，早然木·尼亞孜，等.高良姜揮發(fā)油成分氣相色譜一質(zhì)譜分析[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，31（4）：441-442.

[9] 王雪飛，張榮，姚麗華，等.新疆海罌粟提取物的抗炎作用[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，33（7）：768-770.

（上接第7717頁）

有定向創(chuàng)造遺傳變異、優(yōu)良基因高效重組和聚合等優(yōu)點(diǎn)。通過轉(zhuǎn)基因、點(diǎn)突變等手段創(chuàng)造轉(zhuǎn)錄因子的超表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系或突變體，可進(jìn)一步解析其對抗逆相關(guān)基因的調(diào)控機(jī)理，為提高作物的抗逆性、培育新的抗逆品種奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] MIZOI J，YAMAGUCHISHINOZAKI K.Molecular approaches to improve rice abiotic stress tolerance[J].Rice Protocols，2013，956：269-283.

[2] KANAWAPEE N，SANITCHON J，LONTOM W，et al.Evaluation of salt tolerance at the seedling stage in rice genotypes by growth performance，ion accumulation，proline and chlorophyll content[J].Plant Soil，2012，358：235-249.

[3] 王善仙，劉宛，李培軍，等.鹽堿土植物改良研究進(jìn)展[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2011，27（24）：1-7.

[4] 楊勁松.中國鹽漬土研究的發(fā)展歷程與展望[J].土壤學(xué)報(bào)，2008，45（5）：837-845.

[5] 樊麗琴，楊建國，許興，等.寧夏引黃灌區(qū)鹽堿地土壤鹽分特征及相關(guān)性[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012，28（35）：221-225.

[6] 張?jiān)磁?，胡克林，李保國，?銀川平原土壤鹽分及鹽漬土的空間分布格局[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2009，25（7）：19-24.

[7] WANG Z F，CHENG J P，CHEN Z W，et al.Identification of QTLs with main，epistatic and QTL×environment interaction effects for salt tolerance in rice seedlings under different salinity conditions[J].Theor Appl Genet，2012，125：807-815.

[8] WANKHADE S D，SANZ A.Chronic mild salinity affects source leaves physiology and productivity parameters of rice plants（Oryza sativa L.，cv.Taipei 309）[J].Plant Soil，2013，367（1/2）：663-672.

[9] TIAN L，TAN L B，LIU F X，et al.Identification of quantitative trait loci associated with salt tolerance at seedling stage from Oryza rufipogon[J].J Genet Genomics，2011，38（12）：593-601.

[10] PANDIT A，RAI V，BAL S，et al.Combining QTL mapping and transcriptome profiling of bulked RILs for identification of functional polymorphism for salt tolerance genes in rice.（Oryza sativa L.）[J].Mol Genet Genomics，2010，284：121-136.

[11] LIN H X，ZHU M Z，YANO M，et al.QTLs for Na+ and K+ uptake of the shoots and roots controlling rice salt tolerance[J].Theor Appl Genet，2004，108：253-260.

[12] 范凱，王學(xué)德，袁淑娜，等.植物轉(zhuǎn)錄因子NAP亞家族的研究進(jìn)展[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，47（2）：209-220.

[13] 吳玲云，周波，李玉花.植物WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在脫落酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用[J].分子植物育種，2014，12（2）：404-410.

[14] 伍林濤，杜才富，張敏琴，等.WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)及其在植物抗逆境脅迫中的功能[J].分子植物育種，2013，11（4）：634-638.

[15] TAO Z，KOU Y J，LIU H B，et al.OsWRKY45 alleles play different roles in abscisic acid signalling and salt stress tolerance but similar roles in drought and cold tolerance in rice[J].J Exp Bot，2011，62（14）：4863-4874.

[16] HU H H，DAI M Q，YAO J L，et al.Over expressing a NAM，ATAF，and CUC（NAC）transcription factor enhances drought resistance and salt tolerance in rice[J].Proc Natl Acad Sci USA，2006，103（35）：12987-12992.

[17] HU H H，YOU J，F(xiàn)ANG Y J，et al.Characterization of transcription factor gene SNAC2 conferring cold and salt tolerance in rice[J].Plant Mol Biol，2008，67（1/2）：169-181.

[18] TAKASAKI H，MARUYAMA K，KIDOKORO S，et al.The abiotic stressresponsive NACtype transcription factor OsNAC5 regulates stressinducible genes and stress tolerance in rice[J].Mol Genet Genomics，2010，284（3）：173-183.

[19] NAKASHIMA K，TRAN L S P，VAN NGUYEN D，et al.Functional analysis of a NACtype transcription factor OsNAC6 involved in abiotic and biotic stressresponsive gene expression in rice[J].Plant J，2007，51（4）：617-630.

[20] SONG S Y，CHEN Y，CHEN J，et al.Physiological mechanisms underlying OsNAC5dependent tolerance of rice plants to abiotic stress[J].Planta，2011，234（2）：331-345.

[21] HOSSAIN M A，LEE Y，CHO J I，et al.The bZIP transcription factor OsABF1 is an ABA responsive element binding factor that enhances abiotic stress signaling in rice[J].Plant Mol Biol，2010，72（4/5）：557-566.

[22] MUKHERJEE K，CHOUDHURY A R，GUPTA B，et al.An ABREbinding factor，OSBZ8，is highly expressed in salt tolerant cultivars than in salt sensitive cultivars of indica rice[J].BMC Plant Biol，2006，6（1）：18.

[23] XIANG Y，TANG N，DU H，et al.Characterization of OsbZIP23 as a key player of the basic leucine zipper transcription factor family for conferring abscisic acid sensitivity and salinity and drought tolerance in rice[J].Plant Physiol，2008，148（4）：1938-1952.

[24] DUBOUZET J G，SAKUMA Y，ITO Y，et al.OsDREB genes in rice，Oryza sativa L.，encode transcription activators that function in drought，highsalt and coldresponsive gene expression[J].Plant J，2003，33（4）：751-763.

[25] CUI M，ZHANG W J，ZHANG Q，et al.Induced overexpression of the transcription factor OsDREB2A improves drought tolerance in rice[J].Plant Physiol Biochem，2011，49（12）：1384-1391.

[26] WANG Q Y，GUAN Y C，WU Y R，et al.Overexpression of a rice OsDREB1F gene increases salt，drought，and low temperature tolerance in both Arabidopsis and rice[J].Plant Mol Biol，2008，67（6）：589-602.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，Journal of Anhui Agri. Sci.2014，42（23）：7