不同來源金線蓮活性成分含量的研究

施滿容 龔林光 鐘幼雄

摘要對福建不同地區(qū)野生金線蓮和組培苗4、6月栽培種進行多糖、黃酮、氨基酸、總生物堿含量測定，結(jié)果表明，閩南野生金線蓮4種成分含量均高于閩東野生種，多糖和總氨基酸含量組培苗栽培種均高于野生種，且隨栽培月齡增加而下降；總黃酮和總生物堿含量表現(xiàn)隨栽培月齡增加而上升，組培栽培6個月最高，其次是閩南野生種。

關(guān)鍵詞金線蓮；多糖；黃酮；氨基酸；總生物堿

中圖分類號S567文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）28-09731-04

Research of Activity Components in Different Anoectochilus roxburghii

SHI Manrong1， GONG Linguang2， ZHONG Youxiong1

（1. Ningde Vocational and Technical College， Fuan， Fujian 355000； 2. Fuan Mastery in Quality Supervision and Inspection， Fuan， Fujian 355000）

AbstractPolysaccharides， flavonoids， amino acid， the content of total alkaloids in wild Anoectochilus roxburghii from different regions of Fujian Province and tissue culture seedling（cultivated species in April， June ） were determined. The results showed that， for four kinds of components in wild Anoectochilus roxburghii in south of Fujian， polysaccharides and total amino acid content in plant tissue culture are higher than the wild species in east of Fujian Province， and declines as the cultivation age increases. Total flavonoids and total alkaloids rises as the cultivation age increases. Tissue culture and cultivation are highest in six months， and the second is the wild species in south of Fujian Province.

Key wordsAnoectochilus roxburghii； Polysaccharides； Flavonoids； Amino acid； Total alkaloids

金線蓮（Anoectochilus roxburghii）系蘭科開唇蘭屬（金線蓮屬）多年生草本植物，該屬植物已發(fā)現(xiàn)有35種，在我國約有20種[1]。金線蓮主要分布于亞洲熱帶和亞熱帶地區(qū)及大洋洲，我國主要分布在海拔 300～1 200 m 的丘陵地，福建、廣西、廣東、海南、四川、云南、貴州等均有野生金線蓮。金線蓮對生態(tài)環(huán)境要求嚴格，加之近年自然環(huán)境遭受嚴重破壞，以及人工過度采挖，野生金線蓮越來越少。它在民間使用范圍較廣，素有“藥王”、“神藥”、“金草”、“烏人參”等美稱。有研究表明，金線蓮中氨基酸組成、成分、含量及抗衰老活性微量元素的含量均高于國產(chǎn)和野生西洋參[2]。金線蓮富含多糖、氨基酸、生物堿、黃酮化合物、微量元素、強心苷類、有機酸、甾體化合物等[3]。藥效學研究證實了金線蓮全草水煎液具有降血糖作用[4]，所含的微量元素、多糖、氨基酸等具有抗衰老、提高機體免疫力的作用[5]。該試驗對福建閩東地區(qū)野生金線蓮、閩南地區(qū)野生金線蓮和金線蓮組培苗栽培4月齡、6月齡苗，進行了多糖、黃酮、氨基酸、生物堿的測定，以期為更好地保護野生金線蓮資源、進行組織培養(yǎng)材料選擇、開發(fā)利用栽培金線蓮以及可持續(xù)發(fā)展金線蓮產(chǎn)業(yè)提供理論指導。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象。金線蓮組培栽培4個月苗、金線蓮組培栽培6個月苗、閩南野生金線蓮苗、閩東野生金線蓮苗。測定時間為2014年5月26～28日。

1.1.2主要儀器。7520型紫外可見分光光度計，購自北京普析通用儀器有限公司；EYELA N-1000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，購自EYELA公司；SHBIII循環(huán)水式真空泵，購自河南鄭州長城科工貿(mào)有限公司；EASYpure II超純水儀，購自BarnsTead公司；Sartorius BS 210S 電子天平，購自Sartorius公司。

1.1.3主要試劑。蘆丁、甘氨酸、鹽酸麻黃堿標準品，購自上海江萊生物科技有限公司；無水葡萄糖、三氯化鋁、無水乙醇、苯酚、濃硫酸、檸檬酸、氰化鉀、乙二醇甲醚、茚三酮等試劑均為分析純，市售。

1.2方法

1.2.1多糖含量的測定。

1.2.1.1標準曲線的繪制。精確稱取葡萄糖標準品溶液，分別置于試管（ 18 mm×180 mm）中，加蒸餾水至1.0 ml，加入2.0%苯酚溶液1.0 ml、濃硫酸5.0 ml，混勻，沸水浴加熱 2 min，冷卻后于分光光度計490 nm 處測定吸光度。以試劑空白溶液為參比，以吸光度（X）為橫坐標、質(zhì)量含量（Y）為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.1.2樣品處理。取適量藥材，洗凈、曬干，在40 ℃烘箱中放置1 h，粉碎，過40目篩，精確稱取500 mg，置于25 ml容量瓶中，加水至刻度，于80 ℃水浴加熱90 min，冷卻至室溫，提取液搖勻后過濾。濾液中加入50.0 ml無水乙醇，6 000 r/min離心，棄上清液，沉淀用90%乙醇洗滌2次，6 000 r/min離心，棄上清液，沉淀加水溶解，定容至25 ml，即得樣品液。

1.2.2總氨基酸含量的測定。

1.2.2.1標準曲線的繪制。取標準氨基酸母液將其稀釋成一定濃度，取不同濃度標準氨基酸溶液1 ml，加 0.2 mol/L檸檬酸緩沖溶液（pH=5.0）1 ml，充分混和，加入1 ml KCN-乙二醇甲醚-茚三酮溶液，充分混勻后在100 ℃沸水浴中加熱15 min，取出立即加入3 ml 60%乙醇稀釋。冷卻后，選擇波長570 nm進行比色，以吸光度（X）為橫坐標、質(zhì)量含量（Y）為縱坐標作標準曲線。

1.2.2.2樣品處理。取適量藥材，洗凈、曬干，在40 ℃烘箱中放置1 h，粉碎，過40目篩，精確稱取500 mg，置于研缽中加少量80%乙醇，研磨成勻漿，移于25 ml容量瓶中，用乙醇將殘渣洗入瓶中，最后定容至刻度。過濾，在室溫下減壓蒸發(fā)干燥，蒸發(fā)的最后階段在表面皿上進行，得到固形物。使用前用蒸餾水溶解，定容至25 ml，即得樣品液。

1.2.3黃酮含量的測定。

1.2.3.1標準曲線的繪制。采用三氯化鋁顯色法測定，以蘆丁為標準品，精密稱取蘆丁標準品4.0 mg，用乙醇溶解后定容至10 ml，配成0.4 mg/ml的標準溶液。吸取標準溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 ml分別至10 ml容量瓶中，用乙醇定容至刻度，搖勻。分別取1 ml上述蘆丁標準溶液稀釋液于10 ml干凈試管中，加入1%三氯化鋁溶液0.5 ml以及30%乙醇2.0 ml，振蕩搖勻，靜置反應15 min后在420 nm波長下測定吸光度值，并以吸光度（X）為橫坐標、質(zhì)量含量（Y）為縱坐標制作標準曲線。

1.2.3.2樣品處理。取適量藥材，洗凈、曬干，在40 ℃烘箱中放置1 h，粉碎，過40目篩，精確稱取500 mg，置于錐形瓶中，加無水乙醇25 ml，超聲處理（功率350 W、頻率50 kHz、溫度60 ℃）2 h，濾紙過濾，定容至25 ml，即得金線蓮樣品溶液。

1.2.4總生物堿含量的測定。

1.2.4.1標準曲線的繪制。取鹽酸麻黃堿對照品母液將其稀釋成一定濃度，取不同濃度標準鹽酸麻黃堿溶液1 ml，再精確加入5 ml pH=5.4檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、1 ml 0.1%溴麝香草酚藍溶液、氯仿10 ml，振搖混勻待用。另取1 ml二次純化水，同法操作，作為空白對照液，取氯仿層，在波長418 nm進行比色，以吸光度（X）為橫坐標、質(zhì)量含量（Y）為縱坐標作標準曲線。

1.2.4.2樣品處理。取適量藥材，洗凈、曬干，在40 ℃烘箱中放置1 h，粉碎，過40目篩，精確稱取1 g，于錐形瓶中用50 ml pH=3的酸性水溶液在功率為70 W、溫度為60度的超聲條件下提取1h，提取2次，合并提取液；提取液用氨水調(diào)節(jié)pH至10，于分液漏斗中用等體積氯仿萃取，氯仿萃取液即為樣品液。

2結(jié)果與分析

2.1多糖、總黃酮、總氨基酸、總生物堿回歸方程

對金線蓮多糖、總黃酮、總氨基酸、總生物堿的含量進行測定，分別得到葡萄糖、 蘆丁、氨基酸、總生物堿的含量標準曲線（圖1）以及金線蓮的多糖、總黃酮、總氨基酸和總生物堿測定回歸方程分別為：Y=0.068 3X+0.003 8（R2=0.999 8）、Y=0.101 5X+0.009 2（R2=0.999 6）、Y=0.095 7X+0.004 6（R2=0.999 6）、Y=0.113 7x-0.020 0（R2=0.999 7）。

圖1葡萄糖（a）、 蘆丁（b）、氨基酸（c）和總生物堿（d）標準曲線

2.2不同來源金線蓮多糖含量的比較

從不同來源和不同栽培月齡金線蓮多糖含量測定結(jié)果（圖2）可以看出，4種金線蓮多糖含量為4.74%～10.70%，組培苗栽培種多糖含量均高于野生種，組培苗栽培4個月多糖含量高于栽培6個月多糖含量，閩南野生金線蓮多糖含量高于閩東野生種。這可能是由于培養(yǎng)基中碳素營養(yǎng)豐富，有利于糖類的積累，故組培苗栽培種多糖含量高于野生種；同時組培苗栽培4個月的金線蓮繼代時積累的多糖存在較多，而6個月栽培苗可能多糖已參與物質(zhì)的代謝過程，故含量有所下降。閩南野生金線蓮多糖含量高于閩東野生種可能是由于兩者存在遺傳物質(zhì)差異或與2個地區(qū)生態(tài)環(huán)境差異有關(guān)。

圖2不同來源金線蓮多糖含量比較

2.3不同來源金線蓮總黃酮含量的比較

由圖3可見，不同地區(qū)和不同栽培月齡金線蓮總黃酮含量為0.38%～0.67%，組培苗栽培6個月總黃酮含量高于4個月栽培種，閩南野生金線蓮總黃酮含量高于閩東野生種，其中組培苗栽培6個月總黃酮含量最高，為0.67%，其次是閩南野生種，為0.46%，閩東野生種表現(xiàn)最低，為0.38%。這可能是由于隨著栽培時間的延長組培苗中原積累的多糖參與物質(zhì)代謝，促進了栽培苗內(nèi)黃酮的積累；至于2個地區(qū)野生種黃酮含量差異可能是由于兩者存在遺傳物質(zhì)差異或與2個地區(qū)生態(tài)環(huán)境差異有關(guān)。

圖3不同來源金線蓮黃酮含量比較

2.4不同來源金線蓮總氨基酸含量的比較

從圖4可以看出，不同地區(qū)和不同栽培月齡金線蓮總氨基酸含量為3.26%～6.10%，組培苗栽培4個月總氨基酸含量（6.10%）高于6個月栽培種（4.14%），閩南野生金線蓮總氨基酸含量（3.30%）略高于閩東野生種（3.26%），組培苗栽培種總氨基酸含量均高于野生種。這可能是由于組培苗原培養(yǎng)基中含氮化合物有利于積累氨基酸，故組培苗栽培種氨基酸含量均高于野生種，隨著栽培時間延長，氨基酸重新參與物質(zhì)代謝，故表現(xiàn)出6個月栽培種含量小于4個月栽培種。閩南野生金線蓮氨基酸含量高于閩東野生種可能是由于兩者存在遺傳物質(zhì)差異或與2個地區(qū)生態(tài)環(huán)境差異有關(guān)。

圖4不同來源金線蓮氨基酸含量比較

2.5不同來源金線蓮總生物堿含量的比較

由圖5可見，不同地區(qū)和不同栽培月齡金線蓮總生物堿含量為0.029%～0.066%，組培苗栽培6個月總生物堿含量高于4個月栽培種，閩南野生金線蓮總生物堿含量高于閩東野生種，其中組培苗栽培6個月總生物堿含量最高，為0.066%，其次是閩南野生種，為0.051%，閩東野生種表現(xiàn)最低，為0.029%。這可能是由于隨著栽培時間延長，組培苗內(nèi)積累的營養(yǎng)物質(zhì)參與代謝，有利于生物堿的合成。至于2個地區(qū)野生種生物堿含量差異可能是由于本身兩者存在遺傳物質(zhì)差異或與2個地區(qū)生態(tài)環(huán)境差異有關(guān)。

圖5不同來源金線蓮生物堿含量比較

42卷28期

施滿容等不同來源金線蓮活性成分含量的研究

3結(jié)論與討論

對福建不同地區(qū)和不同栽培月齡組培苗進行多糖、總氨基酸、總黃酮、總生物堿含量的測定，結(jié)果表明，多糖和總氨基酸含量組培苗栽培種均高于野生種，且隨著栽培時間增加而下降；總黃酮和總生物堿含量均表現(xiàn)隨著栽培時間增加而上升，其中組培栽培6個月最高，其次是閩南野生種，4種有效成分含量閩東野生種均表現(xiàn)為最低，這是否是由于閩東野生種苗較小，處于生長初期還是由于本身遺傳物質(zhì)差異或2個地方生態(tài)環(huán)境等自然因素差異有關(guān)，還有待進一步研究。多糖含量隨栽培時間增加而下降，而總黃酮含量隨栽培時間增加而上升，這結(jié)果與黃瑞平等的測定結(jié)果[6]一致。這可能是因為金線蓮在組織培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基營養(yǎng)較豐富，植物的合成代謝較旺盛，多糖和氨基酸作為植物營養(yǎng)物質(zhì)在體內(nèi)持續(xù)積累，金線蓮移入栽培基質(zhì)后，原積累的多糖和氨基酸參與代謝，故隨著栽培時間延長含量降低；黃酮和生物堿作為次生代謝物，可能是在特定環(huán)境條件下會增加其合成量，所以，金線蓮總黃酮和生物堿含量隨著栽培月齡的增加而增加。多糖、總氨基酸、總黃酮、總生物堿是金線蓮的主要有效成分，是金線蓮產(chǎn)品質(zhì)量標準的重要成分，其含量的多少將直接影響金線蓮及其相關(guān)產(chǎn)品的應用功效。

多糖含量栽培4個月最高，達10.70%，比黃瑞平等研究的福建4月齡高[6] ，較王常青等報道的從臺灣金線蓮試管苗中測得水溶性多糖含量（11.1%）稍低[7]，比趙保發(fā)等用水提法從金線蓮干草中提取的最高多糖含量（8.23%）高2.47%[8]。4個樣品黃酮含量測定結(jié)果比黃瑞平等的研究結(jié)果[6，9]稍低，但與張志信等報道的野生金線蓮（0.4%）含量相當或略高[10]。生物堿也是金線蓮的活性成分之一，該研究中，總生物堿的積累以栽培6個月組培苗最高，達0.066%，與林麗清等報道的金線蓮干草中最高含量（0.052 96%）高出0.013%，是最低含量（0.033 20%）的2倍[3]。

測定結(jié)果表明，組培苗栽培4～6月，多糖、總黃酮、總氨基酸、總生物堿含量可以達到甚至超過野生種，在野生資源日益減少的情況下，大力開展組織培養(yǎng)工作來發(fā)展金線蓮產(chǎn)業(yè)，對保護野生植物資源、滿足市場對金線蓮作為保健品和藥用的需求以及為觀賞園藝提供種苗均具有非常重要意義。

參考文獻

[1] 中國科學院中國植物志編委.中國植物志（第17 卷）[M].北京：科學出版社，2000：204.

[2] 唐健，鄧元榮，卓儀榮.金線蓮的藥理活性研究進展[J].海峽藥學，2008，20（ 12）：77-79.

[3] 林麗清，黃麗英，張亞鋒，等.金線蓮總生物堿的提取方法及條件的優(yōu)化[J].中藥材，2006，29（12）：1365-1366.

[4] 陳卓，黃自強.金線蓮及其提取物降血糖實驗研究[J].福建醫(yī)科大學學報，2000，34（4）：350.

[5] 賴應輝，吳錦忠.金線蓮中無機元素及糖類的分析[J].中藥材，1997，20（2）：84.

[6] 黃瑞平，黃穎楨，陳菁瑛，等.不同月齡金線蓮多糖和總黃酮含量的比較[J].熱帶生物學報，2012，3（2）：174-176.

[7] 王常青，嚴成其，王勇，等.臺灣金線蓮多糖的分離純化及其體外抑瘤活性研究[J].中國生化藥物雜志，2008，29（2）：93-96.

[8] 趙保發(fā)，張志信.金線蓮多糖提取工藝的研究[J].云南師范大學學報，2008，28（4）：60-63.

[9] 龔秀會，許 敏，董鴻竹，等.不同基原金線蓮植物的化學成分比較研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2012，40（36）：17530-17531，17607.

[10] 張志信，張鐵，趙保發(fā)，等.文山野生金線蓮總黃酮及多糖含量測定[J].時珍國醫(yī)國藥，2009，20（6）：1362-1364.