少突膠質(zhì)前體細(xì)胞缺血缺氧損傷模型的建立

吳錫艷 何揚(yáng)濤

【摘 要】 目的：建立少突膠質(zhì)前體細(xì)胞缺血缺氧腦白質(zhì)損傷模型。 方法：將大鼠少突膠質(zhì)前體細(xì)胞分為正常對(duì)照組和缺氧缺糖組，正常對(duì)照組細(xì)胞用DMEM-F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，不做缺氧缺糖處理，缺氧缺糖組細(xì)胞用無糖DMEM和Na2S2O4處理，Na2S2O4終濃度為10mmol/L。取處理后10min、30min、60min和90min為觀察點(diǎn)，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和MTT測(cè)定。結(jié)果：與對(duì)照組相比，缺氧缺糖組OPCs形態(tài)隨缺氧缺糖時(shí)間的延長(zhǎng)而發(fā)生明顯改變，細(xì)胞存活率降低。討論：聯(lián)合應(yīng)用無糖培養(yǎng)基和連二亞硫酸鈉可以在常氧培養(yǎng)條件下建立少突膠質(zhì)前體細(xì)胞缺氧缺糖模型。

【關(guān)鍵詞】 少突膠質(zhì)前體細(xì)胞 缺血缺氧模型 建立

【中圖分類號(hào)】 R722.6 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】 A 【文章編號(hào)】 1671-8801（2014）03-0388-01

目前，腦白質(zhì)損傷已成為早產(chǎn)兒腦損傷的重要形式。研究表明，缺氧缺血（HI）、感染和免疫損傷等多種因素均可以導(dǎo)致新生兒腦白質(zhì)損傷的發(fā)生[1]。尤其是缺氧缺血，這與腦白質(zhì)的主要細(xì)胞成分-少突膠質(zhì)細(xì)胞有關(guān)[3]。不同發(fā)育階段的少突膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)缺氧缺血的耐受性不同，晚期少突膠質(zhì)祖細(xì)胞和未成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞最為易損，成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞最為耐受。由于神經(jīng)膠質(zhì)中少突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育最晚，在胎齡24周左右才逐漸由其前體細(xì)胞向成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，因此，早產(chǎn)兒的胎齡越小，其腦白質(zhì)中少突膠質(zhì)的前體細(xì)胞含量越多，就越容易發(fā)生腦白質(zhì)損傷。而目前對(duì)新生兒缺血缺氧性腦?。╤ypoxic-ischemic encephalopathy，HIE）的治療僅局限于支持療法，尚無促進(jìn)神經(jīng)再生的手段[7]。探討缺血缺氧腦白質(zhì)損傷發(fā)生的特點(diǎn)和機(jī)制己成為迫切的需要，尋求簡(jiǎn)單可行的方法建立缺血缺氧腦白質(zhì)損傷模型，則有助于深入了解缺血缺氧引起少突膠質(zhì)前體細(xì)胞損傷的機(jī)制，同時(shí)也能夠?yàn)樘綄び行У母深A(yù)、治療措施提供平臺(tái)。

1 OPCs的培養(yǎng)

按照本實(shí)驗(yàn)室牛建欽的“少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的分離純化方法”[12]培養(yǎng)OPCs。

2 少突膠質(zhì)前體細(xì)胞缺氧缺糖離體模型的建立

取純化培養(yǎng)2天，經(jīng)鑒定為PDGFαR陽(yáng)性的大鼠少突膠質(zhì)前體細(xì)胞制作缺氧缺糖模型。將大鼠少突膠質(zhì)前體細(xì)胞分為正常對(duì)照組和缺氧缺糖組，正常對(duì)照組細(xì)胞用DMEM-F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，不做缺氧缺糖處理，缺氧缺糖組細(xì)胞用無糖DMEM和Na2S2O4處理，Na2S2O4終濃度為10mmol/L。取處理后10min、30min、60min和90min為觀察點(diǎn)。進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和MTT的測(cè)定。

3 結(jié)果

3.1 倒置相差顯微鏡下觀察少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的形態(tài)變化

缺氧缺糖組OPCs形態(tài)隨缺氧缺糖時(shí)間的延長(zhǎng)而發(fā)生明顯改變。缺氧缺糖10分鐘時(shí)，細(xì)胞仍貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞折光性無明顯改變，部分突起出現(xiàn)輕度腫脹，呈節(jié)段樣或“串珠樣”改變，胞體腫脹尚不明顯。缺氧缺糖30分鐘，少量細(xì)胞不能貼壁而開始漂浮，貼壁細(xì)胞折光性減弱，胞體輕度腫脹，細(xì)胞突起節(jié)段樣或“串珠樣”改變更加明顯，部分突起回縮。缺氧缺糖60分鐘，漂浮細(xì)胞增加，貼壁細(xì)胞明顯腫脹、胞體混濁，細(xì)胞突起多數(shù)節(jié)段性腫脹明顯，可見較多突起斷裂。缺氧缺糖90分鐘，大部分細(xì)胞漂浮，剩余細(xì)胞多數(shù)胞體極度腫脹，胞質(zhì)內(nèi)可見大小不等的空泡，細(xì)胞核不清，突起斷裂，可見較多細(xì)胞已經(jīng)崩解。

3.2 MTT法（四哇氮鹽比色實(shí)驗(yàn)）測(cè)定少突膠質(zhì)前體細(xì)胞存活率

結(jié)果顯示，在缺氧缺糖早期，缺氧缺糖組細(xì)胞存活率較正常對(duì)照組已有降低，但尚無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；隨著缺氧缺糖時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率逐漸降低，60min時(shí)，細(xì)胞存活率已降到接近50%，到90min時(shí)，已剩下不到一半細(xì)胞存活，與對(duì)照組相比，差異均有顯著性（P<0.05）（表1）

4 討論

本實(shí)驗(yàn)中，在缺氧缺糖后開始后，細(xì)胞很快就出現(xiàn)形態(tài)學(xué)上面的改變，隨著缺氧缺糖時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞開始出現(xiàn)水腫、細(xì)胞活力明顯減退，細(xì)胞突起水腫、斷裂，直至最后多數(shù)細(xì)胞漂浮，細(xì)胞極度腫脹乃至崩解。MTT法檢測(cè)也提示細(xì)胞存活率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低，至60分鐘時(shí)已降至正常的一半左右，90分鐘時(shí)則已降至正常的一半以下，說明連二亞硫酸鈉和無糖培養(yǎng)基的聯(lián)合應(yīng)用使少突膠質(zhì)細(xì)胞在較短的時(shí)間內(nèi)即出現(xiàn)了缺氧性損傷和丟失，可以模擬嚴(yán)重腦白質(zhì)損傷的細(xì)胞改變情形。但由于缺氧缺糖至90分鐘時(shí)，大部分細(xì)胞己經(jīng)死亡和丟失，不利于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究，故選用存活細(xì)胞大約有50%的60分鐘來作為終止缺氧缺糖的時(shí)間。

參考文獻(xiàn)

[1]Michael V， Johnston， William H， et al. Neurobiology of Hypoxic-Ischemic Injury in the Developing Brain. Pediatric Research， 2001， 49（6）： 735-741.

[2]Volpe JJ. Hypoxic-ischemic encephalopathy. Neurology of the Newborn， 4th edi. Philadelphia： W.B. Saunders company， 2001， 217.

[3]Snyder EY， Wolfe JH. Central nervouse system cell tansplantation： a novel therapy for storage diseases？ Curr Opin Neurol， 1996， 9（2）： 126-136.

[4]牛建欽，肖嵐.P.少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的分離純化方法.2011，7.