人用狂犬病疫苗中β—丙內(nèi)酯殘留量的檢測

劉輝等

【摘 要】 目的：檢測人用狂犬病疫苗中BPL的殘留量。方法：采用氣相色譜法檢測BPL含量，確定最低檢出限，并分析BPL在37℃條件下的水解變化情況，檢測人用狂犬病疫苗中的β-丙內(nèi)酯的殘留量。結(jié)果：氣相色譜法檢測BPL含量的靈敏度為8.96ppm，對人用狂犬病疫苗中的β-丙內(nèi)酯進(jìn)行檢測，未發(fā)現(xiàn)殘留。結(jié)論：氣相色譜法檢測BPL殘留量的靈敏度較高，結(jié)果可靠，可用于人用狂犬病疫苗生產(chǎn)過程中BPL殘留量的檢測。

【關(guān)鍵詞】 β-丙內(nèi)酯（BPL） 氣相色譜法 人用狂犬病疫苗

【中圖分類號(hào)】 R446.1 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】 A 【文章編號(hào)】 1671-8801（2014）03-0326-02

β-丙內(nèi)酯（β-Propiolactone，BPL）又名羥基丙酸內(nèi)酯，是一種雜環(huán)類化合物 （C3H4O2），沸點(diǎn)155℃，常溫下為無色黏稠狀有刺激氣味的液體，對病毒具有很強(qiáng)的滅活作用，其滅活機(jī)制是作用于核酸，改變其結(jié)構(gòu)以達(dá)到滅活目的，在不破壞病毒抗原的同時(shí)，又能保持病毒良好的免疫原性；BPL水解后為無毒性的人體脂肪代謝產(chǎn)物β-羥基丙酸，常用于病毒類疫苗特別是人用狂犬病疫苗的滅活。

但BPL是一種致癌物，對皮膚、黏膜及眼睛有刺激性，因此必須對疫苗中的BPL含量進(jìn)行檢測，確保其已被完全水解，保證疫苗的安全性。本文采用氣相色譜法檢測了BPL的殘留量，并對人用狂犬病疫苗中是否有BPL殘留進(jìn)行了檢測，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

Agilent 公司7890A氣相色譜儀。

1.1.2 試劑

β-丙內(nèi)酯，購自德國SERVA，濃度1.146 g/ml。

PBS緩沖液（pH7.6）；人用狂犬病疫苗原液（以β-丙內(nèi)酯滅活，批號(hào)T-RB20130101，T-RB20130102，T-RB2013003），由成都生物制品研究所有限責(zé)任公司病毒性疫苗研究室提供。

1.2 方法

1.2.1 氣相色譜法分析條件

毛細(xì)管色譜柱為Agilent DB-624；載氣為氮?dú)?，流?ml /min；氣化室溫度180℃；檢測器溫度250℃；柱溫120℃；進(jìn)樣量0.5μl。

1.2.2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

BPL用PBS緩沖液（pH7.6）作1：1000、1：2000、1：4000、1：8000、1：16000、1：32000、1：64000、1：128000、1：256000、1：512000稀釋，分別進(jìn)樣，進(jìn)行氣相色譜法測定。以BPL含量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)以PBS緩沖液（pH7.6）作空白對照。

1.2.3 BPL重復(fù)性檢測情況

BPL用PBS緩沖液（pH7.6）作1：4000稀釋，進(jìn)樣6次，進(jìn)行氣相色譜法測定，考察BPL重復(fù)性檢測情況。

1.2.4 BPL水解變化情況

BPL用PBS緩沖液（pH7.6）作1：4000稀釋，37℃水浴水解，每隔30min抽樣進(jìn)行氣相色譜法測定，檢測BPL含量。

1.2.5 人用狂犬病疫苗原液中BPL水解情況檢測

1.3 批人用狂犬病疫苗原液按1：4000比例加入BPL滅活，37℃水浴水解2h，抽樣進(jìn)行氣相色譜法測定，檢測BPL含量。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

隨著BPL稀釋倍數(shù)的增加，色譜峰面積隨之減小，當(dāng)BPL稀釋至1：512000

時(shí)，未檢測出峰，結(jié)果見表1?？瞻讓φ諢o色譜峰出現(xiàn)。

根據(jù)1：128000稀釋時(shí)的信噪比為2.9，確定本方法的最低檢出限為8.96ppm，根據(jù)表1，以BPL含量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，發(fā)現(xiàn)峰面積與BPL 含量呈線性關(guān)系，Y = 0.0741X + 1.9015，R2 = 0.997，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

2.2 BPL重復(fù)性檢測情況

BPL用PBS緩沖液（pH7.6）作1：4000稀釋，進(jìn)樣6次，進(jìn)行氣相色譜法測定，BPL保留時(shí)間分別為：3.015min、3.018 min、3.016 min、3.011 min、3.009 min、3.011 min，RSD為0.12%；BPL峰面積分別為：25.9、25.5、25.3、26.1、24.9、25.7，RSD為1.68%；兩者均小于2%，表明用氣相色譜法檢測BPL殘留的重復(fù)性良好。BPL色譜圖見圖2。

2.3 BPL水解變化情況

BPL用PBS緩沖液（pH7.6）作1：4000稀釋，37℃水浴水解后進(jìn)樣檢測，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算BPL含量。結(jié)果顯示，隨著水解時(shí)間的延長，BPL含量逐漸降低，水解3.0h后降至最低檢出限以下，見表2。

2.4 人用狂犬病疫苗原液中BPL水解情況

將3批人用狂犬病疫苗原液按1：4000比例加入BPL滅活后，37℃水浴水解2h，進(jìn)行氣相色譜分析。根據(jù)結(jié)果1和2，BPL的出峰時(shí)間為3.015min左右，人用狂犬病疫苗原液在該時(shí)間點(diǎn)無峰出現(xiàn)，未檢測出BPL殘留，說明疫苗原液中BPL已完全水解。見圖3。

3 討論

隨著我國綜合國力和人民生活水平的提高，人們對于醫(yī)藥產(chǎn)品尤其是應(yīng)用于健康人群的疫苗產(chǎn)品的安全要求也越來越高。目前，國內(nèi)大部分疫苗生產(chǎn)企業(yè)都使用BPL滅活狂犬病毒，對于疫苗的安全性評估，雖然有動(dòng)物試驗(yàn)支持，但在生產(chǎn)過程中還應(yīng)檢測BPL的含量，確保BPL完全水解。由于氣相色譜法檢測靈敏度高，樣品用量少，結(jié)果準(zhǔn)確快速可靠，因此在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥物學(xué)、環(huán)境保護(hù)、臨床化學(xué)等領(lǐng)域，已廣泛應(yīng)用于化學(xué)成分的定性定量分析。本文采用氣相色譜法檢測BPL的殘留量，最低檢測限可達(dá)到8.96ppm，用該方法檢測人用狂犬病疫苗中BPL的含量，結(jié)果3批疫苗原液在BPL出峰處均無色譜峰出現(xiàn)，表明在37℃水浴水解2h后，原液中BPL已完全水解，無殘留。該方法準(zhǔn)確可靠，較好地解決了BPL殘留量檢測的問題，可用于狂犬病疫苗生產(chǎn)過程中BPL殘留量的檢測，確保疫苗的安全。

參考文獻(xiàn)

[1]《中華人民共和國藥典》. 2010版，三部。

[2] 徐英，魏然，姜英，等. 氣相色譜法對輪狀病毒疫苗中β-丙內(nèi)酯測定的研究. 微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展，2010，38（3）：21-23.

[3] 張玉慧，高春潤，潘廣域，等. Vero 細(xì)胞人用狂犬病疫苗中β-丙內(nèi)酯殘留量的檢測. 中國生物制品學(xué)雜志，1998，11（3）：144.

[4] 楊健，高軍，張慶義等. β-丙內(nèi)酯含量氣相色譜檢測方法的建立及其水解情況分析. 中國生物制品學(xué)雜志. 2010， 23（3）：323-324，332.

[5] 劉兆文，李福安，錢浩. β-丙內(nèi)酯在人用純化地鼠腎細(xì)胞狂犬疫苗制備中的應(yīng)用研究. 中國人獸共患病雜志. 1999， 15（6）：71-72

[6] 李福安，竇志勇，潘麗靜. 狂犬疫苗滅活后β-丙內(nèi)酯水解的最佳pH 值的選擇. 中國公共衛(wèi)生. 1999， 15（11）：964.

[7] M.O.Schmita-Masse， Analyse de La β-propiolactone Par chromatogphie gaz- liquide I.REcherche d'un reside de β-propiolactone dans le Vaccin antirabique PasteurⅡ. Etude de la courbe d'hydrolyse de La β-propiolactone ápH7.4， Journa l of Chromatoyraphy，70（1972）：128～134.

[8] 陳偉，李忠義，廖輝等. β-丙內(nèi)酯在Vero細(xì)胞HFRS疫苗中的應(yīng)用. 中國公共衛(wèi)生. 2003，19（06）： 669-670.

作者簡介：劉輝，男， 1980年11月3日生，漢族，四川成都人?，F(xiàn)為四川大學(xué)生物治療國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2010級(jí)生物醫(yī)學(xué)工程專業(yè)工程碩士，研究方向?yàn)椋阂呙绲脑O(shè)計(jì)、制備及規(guī)?；a(chǎn)。

指導(dǎo)老師：葉琳，女，現(xiàn)為成都生物制品研究所有限責(zé)任公司研究員。