利用脯氨酸效應(yīng)提高短乳桿菌谷氨酸脫羧酶的熱穩(wěn)定性

方卉，呂常江，花雨嬌，胡升，趙偉睿，方文姬，宋奎，黃俊，梅樂(lè)和

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利用脯氨酸效應(yīng)提高短乳桿菌谷氨酸脫羧酶的熱穩(wěn)定性

方卉1，呂常江1，花雨嬌1，胡升2，趙偉睿2，方文姬1，宋奎1，黃俊1，梅樂(lè)和2

1 浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江 杭州 310023 2 浙江大學(xué) 寧波理工學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江 寧波 315100

方卉, 呂常江, 花雨嬌, 等. 利用脯氨酸效應(yīng)提高短乳桿菌谷氨酸脫羧酶的熱穩(wěn)定性.生物工程學(xué)報(bào), 2019, 35(4): 636–646.Fang H, Lü CJ, Hua YJ, et al. Increasing the thermostability of glutamate decarboxylase from Lactobacillus brevis by introducing proline. Chin J Biotech, 2019, 35(4): 636–646.

以磷酸吡哆醛為輔酶的谷氨酸脫羧酶 (Glutamate decarboxylase，GAD)，能專一、不可逆地催化L-谷氨酸脫去α-羧基生成γ-氨基丁酸。為了提高GAD熱穩(wěn)定性為目標(biāo)，本研究通過(guò)與嗜熱古細(xì)菌中GAD氨基酸序列的比對(duì)及引入脯氨酸策略，最終在短乳桿菌CGMCC No.1306 的GAD突變體中篩選得到熱穩(wěn)定性提高的突變酶G364P。結(jié)果顯示，突變酶G364P在55 ℃的半衰期以及半失活溫度分別比野生酶提高19.4 min和5.3 ℃，并且突變酶G364P的催化效率與野生酶相比沒(méi)有明顯變化。此外，利用分子動(dòng)力學(xué)模擬來(lái)驗(yàn)證突變對(duì)蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的影響，突變酶G364P的均方根偏差 (Root mean square deviation，RMSD) 以及含G364的loop區(qū)域均方根漲落 (Root mean square fluctuation，RMSF) 均比野生酶低，引入脯氨酸增加了364位氨基酸與相鄰氨基酸的疏水相互作用。文中通過(guò)引入脯氨酸成功提高了中GAD的熱穩(wěn)定性，同時(shí)也為其他酶熱穩(wěn)定性的理性設(shè)計(jì)提供了方法學(xué)指導(dǎo)。

谷氨酸脫羧酶，脯氨酸，γ-氨基丁酸，短乳桿菌，熱穩(wěn)定性，分子動(dòng)力學(xué)

γ-氨基丁酸 (γ-aminobutyric acid，GABA) 是一種天然存在的非蛋白質(zhì)氨基酸，具有降血壓、抗抑郁、抗驚厥、改善睡眠等多種重要的生理功能，在食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[1-5]。谷氨酸脫羧酶 (Glutamate decarboxylase，GAD；EC 4.1.1.15) 能專一、不可逆地催化-谷氨酸 (-glutamic acid，-Glu) 脫去α-羧基生成GABA和CO2，通過(guò)蛋白質(zhì)工程手段獲得催化效率更高、穩(wěn)定性更好的GAD突變酶，對(duì)于拓展其工業(yè)應(yīng)用具有重要的意義[6-7]。

GAD廣泛存在于細(xì)菌、酵母和絲狀真菌等各種微生物中，介導(dǎo)胞內(nèi)GABA的合成，并在細(xì)胞抵御外部酸性環(huán)境的過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[8-9]。值得關(guān)注的是，在這些所報(bào)道的菌株中，作為發(fā)酵食品最主要的有益微生物——乳酸菌通常具有較高的GABA合成能力，乳酸菌源GAD也因此受到更為廣泛的關(guān)注[10]。迄今為止，人們已從鮮奶、泡菜、清酒及各種傳統(tǒng)的發(fā)酵乳制品和肉制品中分離并鑒定了數(shù)百株具有GABA合成能力的乳酸菌，分布于8個(gè)屬45個(gè)種和亞種[10-11]。

課題組前期分離并鑒定了多株具有GABA合成能力的乳酸菌[12]。其中，分離于未滅菌生牛奶中的短乳桿菌CGMCC No. 1306具有較高的GABA發(fā)酵性能[13]。隨后，基于分子生物學(xué)手段實(shí)現(xiàn)了該菌株GAD在大腸桿菌中的異源重組表達(dá)，該重組酶在pH為3–6時(shí)具有催化-Glu生成GABA的能力，但當(dāng)pH高于5.6時(shí)，催化活性降至10%以下[14]。此外，本課題組解析了該蛋白的晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID：5GP4)，并通過(guò)定向進(jìn)化及計(jì)算機(jī)輔助的蛋白質(zhì)分子理性設(shè)計(jì)等方法有效地拓寬了其pH催化范圍，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了其催化效率的顯著提升[7, 15]。盡管該蛋白呈現(xiàn)出較高的工業(yè)應(yīng)用潛力，但其穩(wěn)定性相對(duì)較差，當(dāng)溫度高于50 ℃時(shí)，GAD活力顯著下降[12]。因此，如何提高該GAD的熱穩(wěn)定性，對(duì)于實(shí)現(xiàn)其工業(yè)化應(yīng)用具有重要的價(jià)值。

與傳統(tǒng)的定向進(jìn)化相比，利用理性設(shè)計(jì)來(lái)提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性具有目的性強(qiáng)、效率高等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)闡明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系亦具有重要意義[16-18]。目前，提高蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的理性方法主要有同源序列比對(duì)[19]、預(yù)測(cè)折疊自由能[20]、溫度因子 (B-factor) 設(shè)計(jì)[21]、引入二硫鍵[22]、優(yōu)化蛋白質(zhì)表面電荷[23]及脯氨酸效應(yīng)[24]等。大量研究表明，蛋白質(zhì)分子中引入脯氨酸 (Pro) 可以降低蛋白質(zhì)去折疊的骨架熵，增加蛋白質(zhì)的剛性，顯著提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。目前關(guān)于利用脯氨酸效應(yīng)提高GAD熱穩(wěn)定性的研究鮮有報(bào)道。

基于以上分析，本研究首先將CGMCC No. 1306與嗜熱古細(xì)菌的GAD氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，選擇來(lái)自GAD中Pro所對(duì)應(yīng)的GAD氨基酸位點(diǎn)作為突變位點(diǎn)，然后采用定點(diǎn)突變技術(shù)在GAD對(duì)應(yīng)的氨基酸位點(diǎn)引入Pro，并通過(guò)比色法快速篩選具有高熱穩(wěn)定性的GAD突變體，以期提高實(shí)驗(yàn)效率。此外，分別利用YASARA 和PyMOL軟件進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬及可視化剖析，探討蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性提高的機(jī)制，并為進(jìn)一步深入研究GAD家族的熱穩(wěn)定性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

CGMCC 1306、BL21 (DE3)及DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保藏。磷酸吡哆醛 (Pyrodoxal-5′-phosphate，PLP)、硫酸卡那霉素 (Kan)、丹磺酰氯 (DNS-Cl)、改良型Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自生工生物工程 (上海) 股份有限公司；Ⅰ購(gòu)自Thermo Scientific公司；PrimeSTAR Max DNA聚合酶購(gòu)自TaKaRa公司；Ni-NTA 層析介質(zhì)購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；溴甲酚紫 (Bromocresol purple，BCP) 購(gòu)自上海三愛(ài)思試劑有限公司；PCR引物由通用生物系統(tǒng) (安徽) 有限公司合成。

1.2 GABA及L-Glu含量的測(cè)定

將100 μL待測(cè)樣品、900 μL 0.2 mol/L NaHCO3溶液 (pH 9.8) 及500 μL 4 g/L DNS-Cl丙酮溶液混合均勻后置于40 ℃下避光衍生1 h，然后采用HPLC法測(cè)定樣品中的GABA及-Glu含量，具體參考文獻(xiàn)[25]。

1.3 突變文庫(kù)的構(gòu)建

以來(lái)源于GAD的氨基酸序列為參照，使用DNAMAN 軟件進(jìn)行序列比對(duì)獲取目標(biāo)蛋白中可引入Pro的氨基酸殘基位點(diǎn)，并設(shè)計(jì)相應(yīng)定點(diǎn)突變PCR引物。以pET28a(+)-GAD質(zhì)粒為模板，采用表1中的引物，PCR克隆獲取目標(biāo)突變體質(zhì)?；?；使用Ⅰ對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行消化處理 (37 ℃，2 h)，以消除父本模板；采用熱擊轉(zhuǎn)化法將克隆產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。突變體質(zhì)粒經(jīng)通用生物系統(tǒng)(安徽) 有限公司測(cè)序驗(yàn)證后進(jìn)一步轉(zhuǎn)化至BL21(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞中，獲取目標(biāo)重組菌株。

1.4 熱穩(wěn)定性提高突變體的初步篩選及鑒定

為快速篩選出具有較高熱穩(wěn)定性的GAD突變體，建立了基于比色法的GAD突變體篩選流程：突變體接種于96深孔板中，每個(gè)孔裝有1 mL含50 μg/mL Kan的LB培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)12 h后，取100 μL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至上述相同培養(yǎng)體系中；37 ℃、200 r/min再次培養(yǎng)600至0.6–0.8后，加入IPTG至終濃度為 0.5 mmol/L；25 ℃、150 r/min誘導(dǎo)8–12 h后離心收集菌體細(xì)胞，存放至–80 ℃超低溫冰箱；凍融后用150 μL的PBS溶液 (磷酸鈉緩沖液，pH 7.5) 將菌體重懸，加入終濃度為0.5 mg/mL的溶菌酶，于37 ℃靜置1 h以破碎細(xì)胞；離心取上清液，并于55 ℃水浴中處理15 min，隨后立即于冰浴中放置5 min；取處理后的酶液20 μL于96微量孔板中，加入200 μL含有20 mmol/L-Glu的20 mmol/L醋酸鈉緩沖液 (50 μmol/L BCP，0.01 mmol/L PLP，pH 4.8)，48 ℃、200 r/min振蕩2 h后觀察顏色變化。

1.5 野生酶和突變酶的表達(dá)與純化

挑取含重組表達(dá)質(zhì)粒的單菌落并接種至5 mL含50 μg/mL Kan的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)過(guò)夜。隨后，以2% (/) 的接種量轉(zhuǎn)接至200 mL相同培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至600值為0.6–0.8時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，并于25 ℃、150 r/min條件下誘導(dǎo)8 h后離心收集菌體。

將收集的菌體細(xì)胞經(jīng)20 mmol/LPBS (pH 7.5) 離心洗滌2次后重懸于20 mL破胞緩沖液 (20 mmol/L PBS，300 mmol/L氯化鈉，20 mmol/L咪唑，pH 7.5)，在冰浴條件下超聲處理破碎菌體 (超聲功率為300 W，工作3 s，間歇6 s，超聲15 min)。超聲處理完畢后，細(xì)胞破碎液于8 000 r/min、4 ℃下離心30 min，收集上清液，即得含有GAD的粗酶液。粗酶液經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后采用 Ni-NTA親和層析獲取目標(biāo)重組蛋白，并分別采用SDS-PAGE和Bradford法測(cè)定純化后的蛋白純度及濃度。

表1 定點(diǎn)突變引物及其序列

Underlined letters are mutation sites.

1.6 酶活力測(cè)定

GAD酶活力的測(cè)定參考Ueno等[26]所述方法：400 μL底物溶液 (0.2 mol/L醋酸鈉緩沖液，0.01 mmol/L PLP，100 mmol/L-Glu，pH 4.8) 與20 μL純酶在37 ℃條件下反應(yīng)15 min，然后加900 μL 0.2 mol/L NaHCO3溶液 (pH 9.8) 終止反應(yīng)，采用HPLC法測(cè)定反應(yīng)生成的GABA含量。

1.7 野生酶和突變酶酶學(xué)參數(shù)及熱穩(wěn)定性測(cè)定

分別將純化后的野生酶和突變酶在0–70 ℃水浴中孵育15 min，孵育結(jié)束后迅速放置在冰上冷卻5 min，采用上述1.6方法測(cè)定酶活力。設(shè)未經(jīng)溫浴條件下所測(cè)得的酶活力為100%，將經(jīng)過(guò)不同溫度熱處理后所測(cè)得的酶活力折合為相對(duì)剩余酶活力；并以溫度為橫坐標(biāo)，以熱處理后與處理前酶活力的比值為縱坐標(biāo)作圖，采用Origin 8.0軟件進(jìn)行Boltzmann S型函數(shù)擬合，并計(jì)算相對(duì)剩余酶活力降為50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的溫度，即半失活溫度 (5015)。

將野生酶和突變酶在55 ℃條件下分別孵育10–70 min，孵育結(jié)束后迅速放置在冰上冷卻5 min，采用上述1.6方法測(cè)定酶活力。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以經(jīng)過(guò)不同時(shí)間熱處理后與處理前的酶活力的比值為縱坐標(biāo)作圖，通過(guò)Origin8.0 軟件擬合非線性方程= exp(–k?)，一階速率常數(shù) (k) 經(jīng)非線性回歸確定，并計(jì)算相對(duì)剩余酶活力降低為50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的孵育時(shí)間，即半衰期 (1/2)。

采用0.2 mol/L醋酸鈉緩沖液 (含0.01 mmol/L PLP，pH 4.8) 配制不同濃度 (1–100 mmol/L) 的底物 (-Glu) 溶液，利用上述1.6方法測(cè)定酶活力。以底物濃度[]對(duì)反應(yīng)速率[]作圖，通過(guò)Origin 8.0 軟件非線性擬合計(jì)算相應(yīng)的m和max值，根據(jù)cat=max/[0] ([0]為酶初始濃度，單位mmol/L) 計(jì)算求得的cat和催化效率cat/m。

1.8 野生酶和突變酶分子動(dòng)力學(xué)模擬

為進(jìn)一步解釋突變位點(diǎn)對(duì)蛋白構(gòu)象的影響，通過(guò)計(jì)算野生酶及突變酶的分子動(dòng)力學(xué)模擬軌跡中均方根偏差 (Root mean square deviation，RMSD) 和均方根漲落 (Root mean square fluctuation，RMSF)，來(lái)比較野生酶及突變酶整個(gè)系統(tǒng)勢(shì)能的漲落情況和蛋白結(jié)構(gòu)局部區(qū)域的靈活性。本研究以CGMCC 1306 的GAD晶體結(jié)構(gòu) (PDB ID: 5GP4) 為模板，利用FoldX軟件構(gòu)建突變酶的三維結(jié)構(gòu)，并采用YASARA 軟件的Amber14 力場(chǎng)分別對(duì)野生酶和突變酶在313 K下進(jìn)行時(shí)長(zhǎng)為10 ns 的動(dòng)力學(xué)模擬。模擬過(guò)程為：以PDB格式的野生酶和突變酶的三維結(jié)構(gòu)作為分子動(dòng)力學(xué)模擬的初始結(jié)構(gòu)，經(jīng)加氫處理后將晶體結(jié)構(gòu)放置于10 ?×10 ?×10 ? 的立方體盒子中，以0.98 g/L的密度填充水分子，并向體系中添加合適的抗衡離子 (Na+/Cl–)，使模擬系統(tǒng)呈電中性。范德華力相互作用的短程截?cái)嗑嚯x為7.86 ?。采用 Particle Mesh Ewald方法計(jì)算長(zhǎng)程靜電相互作用。模擬結(jié)果數(shù)據(jù)的可視化及分析采用PyMOL軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變文庫(kù)的構(gòu)建

來(lái)源于超嗜熱古細(xì)菌的是一種僅存于高溫地?zé)岘h(huán)境的嚴(yán)格厭氧菌，具有超高的最適生長(zhǎng)溫度 (95 ℃)。Tomita等[27]報(bào)道來(lái)源于GAD的最適反應(yīng)溫度為85 ℃，在80 ℃和90 ℃的半衰期分別為10 h和5.5 h。的GAD氨基酸序列與的GAD氨基酸序列具有44.74%的相似性，應(yīng)用同源比對(duì)策略，選擇來(lái)自GAD中Pro所對(duì)應(yīng)的GAD氨基酸位點(diǎn)作為突變位點(diǎn)，通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)在CGMCC 1306 的GAD中引入Pro的位點(diǎn)分別為M70、K89、S162、A224、Y242、L261、G277、Y284、V306、S323、G364、G372、A427 (圖1)，突變位點(diǎn)在GAD (PDB ID: 5GP4) 三維結(jié)構(gòu)的位置如圖2所示。

2.2 熱穩(wěn)定性提高突變體的初步篩選及鑒定

為快速獲取具有較高熱穩(wěn)定性的GAD突變體，本研究采用比色法對(duì)進(jìn)行熱處理后的GAD酶活力進(jìn)行初篩[28]。BCP是一種酸堿指示劑，其在低于pH 5.0的條件下顯示黃色，高于pH 6.8的條件中呈現(xiàn)紫色，在pH 5.0–6.8時(shí)為淺紫色或橙色。而-Glu在GAD催化生成GABA的過(guò)程中，由于質(zhì)子的消耗和堿性物質(zhì)GABA的產(chǎn)生，使其在弱緩沖體系中的pH隨著反應(yīng)而發(fā)生變化。因此，可通過(guò)向緩沖液中添加一定濃度的BCP作為指示劑用于反應(yīng)體系中GAD活性高低的定性分析。采用上述比色分析方法，利用96深孔板對(duì)13個(gè)突變體進(jìn)行初步篩選。在所考察的體系中，與96微孔板中11號(hào)所在位置的GAD-WT相比 (圖3)，4號(hào)呈現(xiàn)出更深的紫色反應(yīng)，其所對(duì)應(yīng)的突變體為G364P。另外，質(zhì)子化和去質(zhì)子化形式的BCP的吸收光譜見(jiàn)圖4A。兩種形式之間的吸光度的最大差異發(fā)生在590 nm，而進(jìn)一步的590處吸收值也驗(yàn)證了顏色區(qū)別所體現(xiàn)的GAD活性變化 (圖4B)。與GAD-WT相比，G364P在590處的吸收值明顯高于GAD-WT。為此，選擇G364P進(jìn)行進(jìn)一步熱穩(wěn)定性分析。

圖1 L. brevis CGMCC 1306 中GAD氨基酸序列與T. kodakarensis中GAD氨基酸序列對(duì)比結(jié)果圖

圖2 L. brevis CGMCC 1306 GAD三維結(jié)構(gòu)及突變位點(diǎn)

圖3 具有較高熱穩(wěn)定性的GAD突變體的初步篩選

圖4 不同質(zhì)子化狀態(tài)的溴甲酚紫吸收光譜

2.3 野生酶和突變酶的熱穩(wěn)定性

經(jīng)Ni-NTA 親和層析純化后的野生酶及突變酶的SDS-PAGE 檢測(cè)結(jié)果如圖5所示。純化后的突變酶G364P及GAD-WT電泳條帶清晰且單一，其分子量約為56 kDa，與理論分子量相一致。隨后，按照1.6所述方法測(cè)定突變酶G364P與GAD-WT的1/2和5015。由圖6A可見(jiàn)，GAD-WT在55 ℃下的1/2為23.6 min，而突變酶G364P則達(dá)到了43.0 min，是GAD-WT的1.82倍；在55 ℃條件下處理60 min后，GAD-WT的殘余酶活力僅為24.5%，而突變酶G364P的殘余酶活力仍有45.2%。這表明364位點(diǎn)發(fā)生的Pro替換增強(qiáng)了蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，對(duì)熱失活有了更強(qiáng)的抗性，減緩了酶的熱失活速率。由圖6B可見(jiàn)，GAD-WT的5015為56.2 ℃，而突變酶G364P則提高到了61.5 ℃，比GAD-WT提高了5.3 ℃；在60 ℃條件下處理15 min后，GAD-WT的殘余酶活力降為25.3%，而突變酶G364P仍保留65.9%的殘余酶活力。

圖5 野生酶和突變酶的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果圖

圖6 野生酶和突變酶G364P的熱穩(wěn)定性

2.4 野生酶和突變酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

以-Glu為底物，在pH 4.8、37 ℃的條件下，分別測(cè)定GAD-WT及突變酶G364P的米氏動(dòng)力學(xué)常數(shù)，采用Hyperbola 函數(shù)進(jìn)行非線性擬合得到動(dòng)力學(xué)參數(shù)，結(jié)果如表2所示。由表2可知，突變酶G364P的米氏常數(shù)m值 (45.718 mmol/L) 比GAD-WT的m值 (41.283 mmol/L) 高4.435 mmol/L，突變酶G364P對(duì)底物的親和力略微下降。而突變酶G364P的cat值 (31.904 s–1) 與GAD-WT的cat值 (30.461 s–1) 較為接近，說(shuō)明突變酶G364P的催化速率與GAD-WT相比相差不大。此外，突變酶G364P 的cat/m為GAD-WT的0.86倍，即保留了原始GAD催化活性的86%。由此表明，突變酶G364P熱穩(wěn)定性得到提高的同時(shí)，并未顯著降低酶的催化效率。

2.5 野生酶和突變酶的分子動(dòng)力學(xué)模擬

本研究采用YASARA軟件進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬，通過(guò)結(jié)合RMSD值 (圖7A) 與RMSF值 (圖7B)，分析引入的Pro突變位點(diǎn)對(duì)GAD熱穩(wěn)定性的貢獻(xiàn)。由圖7A可知，隨著模擬不斷推進(jìn)，GAD-WT和突變酶G364P的RMSD值起初有個(gè)明顯上升的階段，突變酶G364P的RMSD在1 ns處達(dá)到系統(tǒng)平衡，而野生酶的RMSD在4 ns處才達(dá)到系統(tǒng)平衡。平衡后野生酶的RMSD平均為(5.81±0.41) nm，突變酶G364P的RMSD平均為(3.80±0.69) nm。RMSD越低則分子構(gòu)象越穩(wěn)定。由此說(shuō)明，突變酶G364P的蛋白質(zhì)構(gòu)象位移較小，酶整體柔性有所降低。

表2 突變酶G364P和GAD-WT動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較

圖7 野生酶與突變酶G364P的分子動(dòng)力學(xué)模擬分析

對(duì)GAD-WT和突變酶G364P進(jìn)行時(shí)長(zhǎng)10 ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬，計(jì)算GAD-WT和突變酶G364P每個(gè)氨基酸的RMSF值，可反映模擬過(guò)程中氨基酸的漲落變化狀況。GAD-WT和突變酶G364P的RMSF曲線如圖7B所示。由圖7B可知，突變酶G364P和野生酶柔性最大的區(qū)域均為蛋白質(zhì)的N端，突變酶G364P在蛋白質(zhì)N端以及突變位點(diǎn)的Loop區(qū)域RMSF值小于野生型。由圖2可知，G364位于GAD的Loop區(qū)域并且遠(yuǎn)離活性中心，該Loop區(qū)域在熱運(yùn)動(dòng)作用下易于形變，顯著影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。在該區(qū)域引入Pro后，能增加該區(qū)域的剛性，降低蛋白質(zhì)去折疊的骨架熵。

3 討論

本研究基于比色法可快速篩選經(jīng)熱處理后仍具有高活力的GAD突變酶，可在相對(duì)短的時(shí)間內(nèi)得到性質(zhì)改善的突變酶，節(jié)省時(shí)間成本，對(duì)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)具有積極作用。影響酶的熱穩(wěn)定性因素眾多，酶分子熱穩(wěn)定的內(nèi)在機(jī)制主要包括靜電相互作用[23]、疏水相互作用[29]、氫鍵[30]、二硫鍵[22]、芳香環(huán)的相互作用[31]、氨基酸組成等[24,32]。為深入探討突變酶穩(wěn)定性提高的機(jī)制，本研究利用在線服務(wù)器 (http://pic.mbu.iisc.ernet.in/) 進(jìn)一步對(duì)野生酶及突變酶G364P的364位氨基酸殘基分別進(jìn)行了分子間相互作用的模擬分析。選取疏水相互作用 (距離設(shè)為5 ?) 和氫鍵選項(xiàng)，具體分析方法參照參考文獻(xiàn)[33]，模擬結(jié)果如圖8所示。GAD野生酶的364位氨基酸為Gly，其O原子與Phe366側(cè)鏈的N原子形成空間距離為2.9 ?的氫鍵；突變酶G364P的364位氨基酸是Pro，其O原子與Phe366側(cè)鏈的N原子同樣形成空間距離仍為2.9 ?的氫鍵。突變酶G364P與野生酶相比，364位氨基酸的氫鍵數(shù)量沒(méi)有發(fā)生變化，說(shuō)明對(duì)于突變酶G364P熱穩(wěn)定性的提高，氫鍵貢獻(xiàn)不大。從圖8 C、D中所知，野生酶364位點(diǎn)的Gly并不與其相鄰的氨基酸殘基形成疏水相互作用，但在該位點(diǎn)引入Pro后，突變酶G364P的364位點(diǎn)的Pro與363位點(diǎn)的Leu之間形成疏水相互作用。Pace等[34]研究了疏水相互作用和氫鍵對(duì)22個(gè)不同分子量大小的蛋白質(zhì) (氨基酸殘基介于36–534之間) 穩(wěn)定性的影響，疏水相互作用對(duì)這22個(gè)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性平均貢獻(xiàn)為60%±4%，氫鍵對(duì)這22個(gè)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性平均貢獻(xiàn)為40%±4%。因此，在364位點(diǎn)引入Pro后，突變酶G364P增加了氨基酸殘基之間的疏水相互作用，進(jìn)而使突變酶G364P的熱穩(wěn)定性得到一定的提高。

圖8 突變酶G364P與GAD-WT的364位點(diǎn)附近分子間相互作用模擬

[1] Leventhal AG, Wang YC, Pu ML, et al. GABA and its agonists improved visual cortical function in senescent monkeys. Science, 2003, 300(5620): 812–815.

[2] Inoue K, Shirai T, Ochiai H, et al. Blood-pressure-lowering effect of a novel fermented milk containing γ-aminobutyric acid (GABA) in mild hypertensives. Eur J Clin Nutr, 2003, 57(3): 490–495.

[3] Kai KL, Ruusuvuori E, Seja P, et al. GABA actions and ionic plasticity in epilepsy. Curr Opin Neurobiol, 2014, 26: 34–41.

[4] Diana M, Quílez J, Rafecas M. Gamma-aminobutyric acid as a bioactive compound in foods: a review. J Funct Foods, 2014, 10: 407–420.

[5] Lammens TM, Franssen MCR, Scott EL, et al. Synthesis of biobased-methylpyrrolidone by one-pot cyclization and methylation of γ- aminobutyric acid. Green Chem, 2010, 12(8): 1430–1436.

[6] Ueno H. Enzymatic and structural aspects on glutamate decarboxylase. J Mol Catal B: Enzym, 2000, 10(1/3): 67–79.

[7] Huang J, Fang H, Gai ZC, et al.CGMCC 1306 glutamate decarboxylase: crystal structure and functional analysis. Biochem Biophys Res Commun, 2018, 503(3): 1703–1709.

[8] Lyu CJ, Zhao WR, Hu S, et al. Physiology-oriented engineering strategy to improve gamma-aminobutyrate production in. J Agric Food Chem, 2017, 65(4): 858–866.

[9] Foster JW.acid resistance: tales of an amateur acidophile. Nat Rev Microbiol, 2004, 2(11): 898–907.

[10] Li H, Cao Y. Lactic acid bacterial cell factories for gamma-aminobutyric acid. Amino Acids, 2010, 39(5): 1107–1116.

[11] Dhakal R, Bajpai VK, Baek KH. Production of gaba (γ-Aminobutyric acid) by microorganisms: a review. Braz J Microbiol, 2012, 43(4): 1230–1241.

[12] Huang J, Mei LH, Sheng Q, et al. Purification and characterization of glutamate decarboxylase ofCGMCC 1306 isolated from fresh milk. Chin J Chem Eng, 2007, 15(2): 157–161.

[13] Xia J. Breeding of γ-aminobutyric acid-producingand optimization of fermentation conditions[D]. Hangzhou: Zhejiang University, 2016 (in Chinese).夏江. 產(chǎn)γ-氨基丁酸的乳酸菌菌株選育及其發(fā)酵條件優(yōu)化[D]. 杭州: 浙江大學(xué), 2006.

[14] Fan EY, Huang J, Hu S, et al. Cloning, sequencing and expression of a glutamate decarboxylase gene from the GABA-producing strainCGMCC 1306. Ann Microbiol, 2012, 62(2): 689–698.

[15] Yu K, Lin L, Hu S, et al. C-terminal truncation of glutamate decarboxylase fromCGMCC 1306 extends its activity toward near-neutral pH. Enzyme Microb Technol, 2012, 50(4/5): 263–269.

[16] Yang HQ, Liu L, Li JH, et al. Rational design to improve protein thermostability: recent advances and prospects. ChemBioEng Rev, 2015, 2(2): 87–94.

[17] Durrenberger M, Ward TR. Recent achievments in the design and engineering of artificial metalloenzymes. Curr Opin Chem Biol, 2014, 19: 99–106.

[18] Jones BJ, Lim HY, Huang J, et al. Comparison of five protein engineering strategies for stabilizing an α/β-hydrolase. Biochemistry, 2017, 56(50): 6521–6532.

[19] Max KEA, Wunderlich M, Roske Y, et al. Optimized variants of the cold shock protein fromselection: structural basis of their high thermostability. J Mol Biol, 2007, 369(4): 1087–1097.

[20] Benedix A, Becker CM, de Groot BL, et al. Predicting free energy changes using structural ensembles. Nat Methods, 2009, 6(1): 3–4.

[21] Reetz MT, Carballeira JD, Vogel A. Iterative saturation mutagenesis on the basis of B factors as a strategy for increasing protein thermostability. Angew Chem Int Ed, 2006, 118(46): 7909–7915.

[22] Xie DF, Fang H, Mei JQ, et al. Improving thermostability of ()-selective amine transaminase fromthrough introduction of disulfide bonds. Biotechnol Appl Biochem, 2018, 65(2): 255–262.

[23] Strickler SS, Gribenko AV, Gribenko AV, et al. Protein stability and surface electrostatics: a charged relationship. Biochemistry, 2006, 45(9): 2761–2766.

[24] Huang J, Jones BJ, Kazlauskas RJ. Stabilization of an α/β-hydrolase by introducing proline residues: salicylicacid binding protein 2 from tobacco. Biochemistry, 2015, 54(28): 4330–4341.

[25] Chen XX, Li D, Lü JX, et al. Determination of-aminobutyric acid and glutamic acid in human cerebrospinal fluid by high performance liquid chromatography. Chin J Chromatogr, 1997, 15(3): 237–239 (in Chinese). 陳希賢, 李東, 呂建新, 等. 高效液相色譜法測(cè)定人腦脊液中-氨基丁酸和谷氨酸. 色譜, 1997, 15(3): 237–239.

[26] Ueno Y, Hayakawa K, Takahashi S, et al. Purification and characterization of glutamate decarboxylase fromIFO 12005. Biosci Biotechnol Biochem, 1997, 61(7): 1168–1171.

[27] Tomita H, Yokooji Y, Ishibashi T, et al. An archaeal glutamate decarboxylase homolog functions as an aspartate decarboxylase and is involved in β-alanine and coenzyme a biosynthesis. J Bacteriol, 2014, 196(6): 1222–1230.

[28] Yu K, Hu S, Huang J, et al. A high-throughput colorimetric assay to measure the activity of glutamate decarboxylase. Enzyme Microb Technol, 2011, 49(3): 272–276.

[29] Gromiha MM, Pathak MC, Saraboji K, et al. Hydrophobic environment is a key factor for the stability of thermophilic proteins. Proteins, 2013, 81(4): 715–721.

[30] Shirley BA, Stanssens P, Hahn U, et al. Contribution of hydrogen bonding to the conformational stability of ribonuclease T1. Biochemistry, 1992, 31(3): 725–732.

[31] Burley SK, Petsko GA. Aromatic-aromatic interaction: a mechanism of protein structure stabilization. Science, 1985, 229(4708): 23–28.

[32] Deckert G, Warren PV, Gaasterland T, et al. The complete genome of the hyperthermophilic bacterium. Nature, 1998, 392(6674): 353–358.

[33] Tina KG, Bhadra R, Srinivasan N. PIC: protein interactions calculator. Nucleic Acids Res, 2007, 35(S2): W473–W476.

[34] Pace CN, Fu HL, Fryar KL, et al. Contribution of hydrophobic interactions to protein stability. J Mol Biol, 2011, 408(3): 514–528.

Increasing the thermostability of glutamate decarboxylase fromby introducing proline

Hui Fang1, Changjiang Lü1, Yujiao Hua1, Sheng Hu2, Weirui Zhao2, Wenji Fang1, Kui Song1, Jun Huang1, and Lehe Mei2

1 School of Biological and Chemical Engineering, Zhejiang University of Science and Technology, Hangzhou 310023, Zhejiang, China 2 Department of Biological and Pharmaceutical Engineering, Ningbo Institute of Technology, Zhejiang University, Ningbo 315100, Zhejiang, China

Glutamate decarboxylase, a unique pyridoxal 5′-phosphate-dependent enzyme, catalyzes α-decarboxylation of-glutamate to γ-aminobutyrate. However, glutamate decarboxylase from different sources has the common problem of poor thermostability that affects its application in industry. In this study, proline was introduced at 13 different positions in glutamate decarboxylase by using the design strategy of homologous sequence alignment betweenandCGMCC No.1306. A mutant enzyme G364P with higher thermostability was obtained. Compared to the wild type, thermostability of the mutant G364P was significantly improved, the half-life time (1/2) at 55 °C and the semi-inactivation temperature (5015)of the mutant G364P increased 19.4 min and 5.3 °C, respectively, whilecat/mof the mutant enzyme remained nearly unchanged. Further analysis of their thermostability by molecular dynamics simulations were performed. The root mean square deviation of G364P and root mean square fluctuation in the loop region including G364 were lower than the wild type at 313 K for 10 ns, and G364P increased one hydrophobic interaction in the loop region. It proves that mutation of flexible 364-Gly to rigid proline endows glutamate decarboxylase with enhanced thermostability.

glutamate decarboxylase, proline, γ-aminobutyric acid,, thermostability, molecular dynamics

10.13345/j.cjb.180390

September 20, 2018;

December 4, 2018

National Natural Science Foundation of China (Nos. 31470793, 31670804, 31240054), Natural Science Foundation of Zhejiang Province (Nos. LY16B060008, LZ13B060002).

Jun Huang. Te/Fax: +86-571-85070370; E-mail: hjunlzr@163.com

Lehe Mei. Te/Fax: +86-574-88229101; E-mail: meilh@zju.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金(Nos. 31470793, 31670804, 31240054)，浙江省自然科學(xué)基金 (Nos. LY16B060008，LZ13B060002) 資助。

(本文責(zé)編 郝麗芳)