Fas/FasL在輻射誘導(dǎo)膽管癌細(xì)胞凋亡發(fā)生和調(diào)控中的作用

趙曉丹 劉崢嶸 王紅巖

【摘 要】膽管癌發(fā)病率逐年升高，但研究進(jìn)展緩慢，發(fā)病機(jī)理遠(yuǎn)未明了，早期診斷困難，外科治療棘手，放化療均不敏感，預(yù)后差，是腫瘤臨床的一大難題。但隨著細(xì)胞凋亡的研究的進(jìn)一步深入，給膽管癌的診治帶來了希望。Fas/FasL系統(tǒng)是凋亡發(fā)生和調(diào)控的重要因子。放療對(duì)腫瘤的作用主要是誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡。而在輻射誘導(dǎo)膽管癌細(xì)胞的凋亡中弄清Fas/FasL對(duì)其調(diào)控機(jī)制對(duì)膽管癌的發(fā)生發(fā)展，診斷治療及預(yù)后都有重要意義，本文結(jié)合有關(guān)文獻(xiàn)作一綜述。

【關(guān)鍵詞】膽管癌；輻射誘導(dǎo)；細(xì)胞凋亡 Fas/FasL

【文章編號(hào)】1004-7484（2014）04-2115-02

1 對(duì)細(xì)胞凋亡途徑的研究

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的一種基本生物學(xué)現(xiàn)象，在多細(xì)胞生物去除不需要的或異常的細(xì)胞中起著必要的作用。它在生物體的進(jìn)化、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定以及多個(gè)系統(tǒng)的發(fā)育中起著重要的作用。目前對(duì)細(xì)胞凋亡途徑的研究已比較深入，總結(jié)查閱的文獻(xiàn)，目前已知的途徑有四種：

A死亡受體通路：又稱細(xì)胞外通路或細(xì)胞膜途徑。由死亡配體（如TNFα，F(xiàn)asL，TWEAK，TRAIL）與對(duì)應(yīng)的死亡受體（TNFR，F(xiàn)as，DR3，DR4/DR5）結(jié)合后啟動(dòng)。此結(jié)合導(dǎo)致受體的三聚化，其胞內(nèi)募集一些接頭蛋白（如TRADD、FADD）及胱冬肽酶（caspase-8）酶原形成一種信號(hào)復(fù)合物，復(fù)合物中的caspase-8酶原通過自身的蛋白酶水解作用形成活性形式，然后它將啟動(dòng)caspase的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使caspase-3、-6、-7激活，這幾種caspase可降解胞內(nèi)結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。此通路基本上不受bcl-2家族的影響。

B線粒體途徑：又稱細(xì)胞內(nèi)通路。這條通路中細(xì)胞色素c的釋放是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵步驟，釋放到細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞色素C在dATP存在的條件下能與凋亡相關(guān)因子1（Apaf-1）結(jié)合，使其形成多聚體，并促使caspase-9與其結(jié)合形成凋亡小體，caspase-9被激活，被激活的caspase-9能激活其他的caspase（如caspase-3等），從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞色素C從線粒體釋放的調(diào)節(jié)是細(xì)胞凋亡分子機(jī)制研究的關(guān)鍵問題。多數(shù)凋亡刺激因子通過線粒體激活細(xì)胞凋亡途徑。Bcl-2基因蛋白家族在這條通路中起了重要的作用。

C顆粒酶B直接活化效應(yīng)Caspase途徑[1]。顆粒酶B（granzyme B）是CTL細(xì)胞的一個(gè)重要?dú)淦?，它是已知唯一能夠激活Caspase的非Ca sp a se酶。在CTL細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)中，Caspase成員受顆粒酶B激活，通過酶解級(jí)聯(lián)反應(yīng)，切割PARP，導(dǎo)致DNA片段化，終至細(xì)胞死亡。

D內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑：細(xì)胞凋亡中鈣離子起了很重要的作用，在細(xì)胞凋亡過程中DNA的消化需要相關(guān)的Ca2+依賴性核酸內(nèi)切酶的參與。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑主要受caspase12調(diào)控，也受Bcl-2家族蛋白質(zhì)的調(diào)控。

2 輻射誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究

輻射可作用于細(xì)胞核和細(xì)胞膜，分別引起DNA損傷和神經(jīng)酰胺的產(chǎn)生，DNA損傷和神經(jīng)酰胺介導(dǎo)兩種不同的凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[2]。

2.1 DNA損傷介導(dǎo)的凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

輻射導(dǎo)致的DNA損傷后，有3種酶被激活：毛細(xì)管擴(kuò)張失調(diào)癥突變激酶（ATM）、ATM相關(guān)激酶（ATR）和DNA依賴的蛋白激酶（DNA-PK）。電離輻射時(shí)，主要是ATM使p53第15位上絲氨酸殘基磷酸化，破壞了p53-Mdm2的相互作用，取消了Mdm2對(duì)p53的抑制作用，導(dǎo)致p53穩(wěn)定性和活性增強(qiáng)。p53激活以后又可通過線粒體和死亡受體兩種不同的途徑導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[3]。

2.1.1.線粒體通路：p53上調(diào)Bax的表達(dá)，Bax轉(zhuǎn)移到線粒體外膜上，誘導(dǎo)線粒體釋放出促凋亡蛋白，如細(xì)胞色素C和凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）等[4]，在ATP或dATP存在的情況下，細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）相結(jié)合并促使Apaf-1形成寡聚體。由于Apaf-1與caspase-9前體之間具有同源結(jié)構(gòu)域，通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，Apaf-1募集胞漿中的caspase-9前體并以1∶1的比例與之結(jié)合，因此caspase-9前體也形成了聚合體。聚合的caspase-9前體通過自我活化產(chǎn)生了具有活性的caspase-9，caspase-9又活化caspase-3和caspase-7?；罨痗aspase-3反過來又能激活caspase-9酶原，形成正反饋通路。caspase-3和caspase-7都是凋亡過程的主要水解酶，通過水解特異的蛋白底物而引起細(xì)胞凋亡[5]?；罨腸aspases反過來也可直接作用于線粒體外膜，引起外膜通透性增強(qiáng)，有利于細(xì)胞色素C釋放。

2.1.2.死亡受體通路：電離輻射可通過p53依賴的方式誘導(dǎo)死亡受體Fas及其配體Fas L（即CD95 L或CD178）的表達(dá)。p53增強(qiáng)Fas基因的轉(zhuǎn)錄，腫瘤細(xì)胞受到電離輻射后Fas L表達(dá)增強(qiáng)[6]FAS/FASL系統(tǒng)激活后通過死亡途徑介導(dǎo)凋亡。

2.2神經(jīng)酰胺介導(dǎo)的凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

輻射作用于細(xì)胞膜受體（如Fas受體和TNFα受體等），死亡受體聚合除了可以激活死亡受體凋亡通路以外，還可以激活酸性/中性鞘磷脂酶，產(chǎn)生神經(jīng)酰胺[7]。另外，神經(jīng)酰胺的產(chǎn)生途徑還有：①激活神經(jīng)酰胺合成酶，從頭合成神經(jīng)酰胺；②輻射直接裂解鞘磷脂產(chǎn)生神經(jīng)酰胺[8]。神經(jīng)酰胺是一種重要的第2信使，介導(dǎo)細(xì)胞的增殖、分化、生長抑制和凋亡等，其生物活性的多樣性與細(xì)胞類型有關(guān)[9]。神經(jīng)酰胺主要通過激活MAPK信號(hào)通路和抑制Akt/PKB信號(hào)通路協(xié)同作用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

3 膽管癌細(xì)胞凋亡與Fas/FasL

3.1Fas/FasL研究現(xiàn)狀

3.1.1 Fas/FasL的結(jié)構(gòu)與功能

Fas又稱Apo-1或CD95分子，屬于腫瘤壞死因子/神經(jīng)生長因子受體家族成員。Fas基因定位于人染色體10q23，其編碼產(chǎn)物為相對(duì)分子質(zhì)量45×103的Ⅰ型跨膜蛋白，由胞外區(qū)（157aa）、穿膜區(qū)（17aa）及胞漿區(qū)（145aa）組成。Fas的天然配體FasL（Fasligand），屬于腫瘤壞死因子/神經(jīng)生長因子超家族成員，在體內(nèi)主要以膜結(jié)合形式存在，定位于人染色體1q23，其基因的編碼產(chǎn)物為相對(duì)分子質(zhì)量40×103的Ⅱ型跨膜蛋白。Fas/FasL結(jié)合是激活體內(nèi)Fas凋亡信號(hào)的惟一有效途徑。Fas/FasL介導(dǎo)的凋亡，在生物體內(nèi)有重要的生理功能：①參與克隆選擇，使與自身抗原發(fā)生反應(yīng)的T細(xì)胞凋亡；②介導(dǎo)細(xì)胞毒作用，殺傷靶細(xì)胞；③激活細(xì)胞誘導(dǎo)死亡（activation-inducedcell death，AICD）；④免疫赦免的形成，使眼、睪丸等器官免受免疫系統(tǒng)的攻擊；⑤參與免疫耐受的形成

3.1.2 Fas/FasL信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 Fas-FasL結(jié)合觸發(fā)多個(gè)不同的路徑，并涉及半胱氨酸蛋白酶系列（caspases）錯(cuò)綜復(fù)雜的相互作用。目前認(rèn)為至少有4個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑，包括2個(gè)主要途徑和2個(gè)其它途徑。

3.1.2.1 主要途徑一：受CD95L刺激，CD95發(fā)生微聚化，通過同種蛋白相互作用，CD95誘導(dǎo)含死亡域（DD）的接頭蛋白FADD（Fas-associated death domain聚合，F(xiàn)ADD利用其另一結(jié)構(gòu)域DED募集含DED的caspase-8，c-FLIP，caspase-10，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合體（DISC），在DISC上出現(xiàn)大量活化的caspase-8，足以切割caspase-3，細(xì)胞呈現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變，此過程不需要線粒體參與。，F(xiàn)as信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)又分成兩個(gè)不同的分枝路徑，這兩個(gè)途徑都依賴caspase-8的激活。一個(gè)分枝途徑直接引起其它c(diǎn)aspases的一連串的水解活化。另一個(gè)分枝途徑稱脂質(zhì)途徑，包括鞘磷脂水解和神經(jīng)酰胺積聚。以上Fas/FasL信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑的特點(diǎn)是需要足夠量的DISC，通過caspase-8的活化直接激活下游效應(yīng)因子caspase-3，caspase-6和caspase-7。具有這些Fas信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)特征的細(xì)胞稱為Ⅰ型細(xì)胞[11，12，13]

3.1.2.2主要途徑二：Fas-FasL相互作用后，細(xì)胞內(nèi)沒有形成足夠量的DISC，caspase-8活化少，不足以切割caspase-3，它可能受凋亡抑制蛋白（IAP）保護(hù)，但此少量的caspase-8卻能切割胞漿中只含BH3結(jié)構(gòu)域的Bcl-2家族成員Bid（Bcl-2 interacting domain）蛋白，產(chǎn)生的tBid移位到線粒體，誘導(dǎo)線粒體損傷，線粒體內(nèi)促凋亡蛋白釋放，增強(qiáng)了凋亡信號(hào)，最終活化下游caspase-9，此過程必須依賴線粒體作用[10]。這一Fas/FasL信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑的特點(diǎn)是caspase-9的激活發(fā)生在線粒體膜電位的變化之后，最后激活的caspase-9激活下游效應(yīng)因子caspase-3，caspase-6和caspase-7。具有這些Fas信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)特征的細(xì)胞稱為Ⅱ型細(xì)胞[12，13，14]。

3.1.2.3 其它途徑一：Fas與FasL有效結(jié)合后，通過另一接頭分子-受體作用蛋白（RIP）（一種絲氨酸/蘇氨酸激酶）與RAIDD [RIP-associating IL-1βconverting-enzyme-like protease 1 （ICH-1）-homologous DD]和caspase-2（ICH-1）形成一復(fù)合物，轉(zhuǎn)導(dǎo)Fas信號(hào)，并且不依賴caspase-8的激活。

3.1.2.4 其它途徑二：此途徑是由另外一種Fas相關(guān)蛋白死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白（DAXX）與凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1（ASK1）形成復(fù)合物，熱休克蛋白Hsp27可抑制此復(fù)合物的形成[14～17]，然后此復(fù)合物激活c-JNK（c-Jun N-terminalkinase）和絲裂原，活化蛋白激酶p38，活化的p38激活caspases有關(guān)蛋白的基因轉(zhuǎn)錄。

3.2 FAS/FASL在膽管癌細(xì)胞的表達(dá)及意義

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，已初步了解膽管癌發(fā)生的相關(guān)因素與步驟。Fas/FasL系統(tǒng)的失調(diào)導(dǎo)致膽管癌細(xì)胞凋亡障礙并產(chǎn)生免疫逃逸，在膽管癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中起著重要作用。有研究表明人肝門部膽管癌表達(dá)具有功能的FasL，因而膽管癌可通過FasL的表達(dá)來反擊人體免疫系統(tǒng)、獲得免疫赦免以助于其惡性生長。由此看來，“Fas-反擊”可能是人肝門部膽管癌免疫逃逸的一潛在的關(guān)鍵性的機(jī)制。而有些研究表明膽管癌同樣表達(dá)FAS，但卻沒有介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，即出現(xiàn)所謂的FAS/FASL抵抗，究其原因可能有以下幾方面：1.Fas受體的因素即受體的質(zhì)和量異常，膽管癌細(xì)胞不表達(dá)、低表達(dá)FAS抗原或表達(dá)無功能FAS[18-20]，亦或發(fā)生基因突變或呈可溶性分泌形式sFas，可以中和FASL間接抑制凋亡。2.FAS信號(hào)傳導(dǎo)途徑缺陷。表現(xiàn)為FADD等低表達(dá)或功能障礙、caspase-8點(diǎn)突變，caspase-1下調(diào)[21，22]，F(xiàn)LIPs阻斷FADD與pro-Caspase-8的作用，進(jìn)而阻斷FAS受體的下游信號(hào)傳導(dǎo)。3.膽管癌細(xì)胞中還可能存在抑癌基因突變以及癌基因的協(xié)同作用[23]，如P53的突變導(dǎo)致FAS損傷，c-myc基因表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致腫瘤通過FAS抵抗而得以惡化。4.膽管癌組織表達(dá)BCL-XL MCL-1 可阻斷FAS介導(dǎo)的凋亡。

3.3 FAS/FASL對(duì)誘導(dǎo)膽管癌細(xì)胞凋亡的調(diào)控

有研究[24，25，26]表明，射線照射可誘發(fā)鼠胸腺細(xì)胞及脾臟T、B細(xì)胞凋亡，并伴有Fas表達(dá)明顯升高。表明輻射導(dǎo)致或誘發(fā)了Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。而在為數(shù)不多的研究文獻(xiàn)中，也發(fā)現(xiàn)輻射也可誘導(dǎo)膽管癌細(xì)胞凋亡，并也伴有FAS的表達(dá)升高。FAS/FASL系統(tǒng)可通過多種途徑介導(dǎo)凋亡，但在輻射誘導(dǎo)膽管癌細(xì)胞凋亡的過程中主要是通過哪種途徑介導(dǎo)的，目前沒有相關(guān)研究。FAS/FASL系統(tǒng)介導(dǎo)凋亡的過程中也受到多種抑制因子的調(diào)控。也就是說并不是所有表達(dá)FAS的膽管癌細(xì)胞系都對(duì)抗Fas抗體敏感。這些抑制因子包括SFAS、DcR3（decoy receptor 3，與Fas競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合FasL），F(xiàn)AP-1（fas-associated phosphatase-1具有與Fas細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域相互作用的能力，終止Fas誘導(dǎo)的凋亡），凋亡抑制劑蛋白IAPs

（inhibitors of apoptosis可與caspase-3，caspase-7，caspase-9的結(jié)合并抑制其活性），Bcl-2和Bcl-XL過表達(dá)可阻止線粒體釋放細(xì)胞色素C，從而保護(hù)Fas凋亡中的線粒體，等等。這也許可以解釋膽管癌對(duì)放療敏感差，但目前對(duì)于這些抑制因子在輻射誘導(dǎo)膽管癌凋亡過程中的表達(dá)水平?jīng)]有相關(guān)報(bào)道。由上可看出，F(xiàn)as介導(dǎo)敏感性膽管癌細(xì)胞死亡必須具備至少三個(gè)條件：①細(xì)胞表面的Fas受體增加，②Fas與其廣泛交聯(lián)的特異性配體結(jié)合促進(jìn)Fas受體帽的形成，③胞內(nèi)凋亡拮抗蛋白（如Fap-1）的移除。

4 結(jié)語

膽管癌無論從早期診斷還是治療上都非常棘手，隨著細(xì)胞凋亡研究的不斷深入，為膽管癌的診治帶來了希望。通過各種化學(xué)藥物或局部輻射誘導(dǎo)膽管癌細(xì)胞凋亡已成為研究熱點(diǎn)。但其中許多機(jī)制尚不清楚。如輻射誘導(dǎo)膽管癌細(xì)胞凋亡中FAS/FASL如何參與凋亡調(diào)控目前還沒有太多研究。輻射誘導(dǎo)膽管癌細(xì)胞凋亡的過程中FAS/FASL主要是通過哪種途徑介導(dǎo)的，膽管癌細(xì)胞是屬于I型還是II型細(xì)胞，輻射是否可以激活膽管癌細(xì)胞膜表面其他受體途徑，如TNFR-2-NFκB軸的活化，該軸可抑制凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖，如有激活這兩者之間是如何相互調(diào)控的。Caspase眾多底物中哪些對(duì)誘導(dǎo)膽管癌細(xì)胞凋亡有調(diào)控作用等等。故弄清輻射誘導(dǎo)膽管癌細(xì)胞凋亡中Fas/Fasl的調(diào)控機(jī)制有助于發(fā)現(xiàn)腫瘤治療的新方法，為膽管癌的治療提供更多的出路。

參考文獻(xiàn)

[1] L. Cristina Gavrilescu and Eric Y. Denkers Apoptosis and the Balance of Homeostatic and Pathologic Responses to Protozoan Infection Infect Immun. 2003 November； 71（11）： 6109–6115

[2] Radford IR.Initiation of ionizing radiation-induced apoptosis：DNAdam-age-mediated or does ceramide have a role？ Int J Radiat Biol，1999，75：521-528.

[3] Khosravi R，Maya R，Gottlieb T，et al.Rapid ATM-dependent phospho-rylation of MDM2 precedes p53 accumulation in response to DNA dam-4 Schuler M，Green DR.Mechanisms of p53-dependent apoptosis.BiochemSoc Trans，2001，29：684-688.

[4] Schuler M，Green DR.Mechanisms of p53-dependent apoptosis.Biochem Soc Trans，2001，29：684-688.

[5] Bratton SB，MacFarlaneM，Cain K，et al.Protein complexes activate distinct caspase cascades in death receptor and stress-induced apoptosis.Exp Cell Res，2000，256：27-33.

[6] Sheard MA.Ionizing radiation as a response-enhancing agent for CD95-mdeiated apoptosis.Int J Cancer，2001，96：220

[7] Chatterjee M，Wu S.Cell line dependent involvement of ceramide in ul-traviolet light-induced apoptosis.Mol Cell Biochem，2001，219：21-27.

[8] Grether-Beck S，Bonizzi G，Schmitt-Brenden H， et al.Non-enzymatic triggering of the ceramide signalling cascade by solar UVA radiation.EMBO J，2000，19：5793-5800.

[9] 丁振華，范建中，主編.紫外輻射生物學(xué)與醫(yī)學(xué).北京：人民軍醫(yī)出版社，2000.114-116.

[10] 鄭英如，陳竹欽Bcl-2的抗凋亡機(jī)制 生物學(xué)雜志，1997，14（6）：8～9

[11] Suneel D， Mundle， Azra Raza. Defining the dynamics of self-assembled Fas-receptor activation [ J]. Trends in Immunology，2002， 23（4）：187-194.

[12] Hengartner MO. The biochemistry of apoptosis[J]. Nature，2000， 407（6805）： 770-776

[13] Kaufmann SH， Earnshaw WC. Induction of apoptosis by cancer chemotherapy[J].Exp Cell Res， 2000， 256（1）： 42-49.

[14] Fulda S， Meyer E， Friesen C，et al. Cell type specific involvement of death receptor and mitochondrial pathways in drug-induced apoptosis[J]. Oncogene， 2001， 20（9）： 1063-1075.

[15] Villunger A， Huang DC， Holler N，et al. Fas ligand-induced c-Jun kinase activation in lymphoid cells requires extensive receptor aggregation but is independent of DAXX， and Fas-mediated cell death does not involve DAXX， RIP， or RAIDD[J]. J Immunol，2000， 165（3）： 1337-1343.

[16] Harald. The Fas signaling pathway： more than a paradigm[J].Science， 2002， 296（31）； 1635-1636.

[17] Cremesti A， Paris F， Grassme H，et al. Ceramide enables fas to cap and kill. laboratory of signal transduction and department of radiation oncology[J]. J Biol Chem， 2001， 276 （26）： 23954-23961

[18] Pitti RM， Maddux BA， Marsters SA， et al. Genomic amplification of a decoy receptor for fas ligand in lung and clolon concer. Nature， 1998；396：699-703

[19] von bernstorff W， Spanjaard RA， Chan AK， et al. Pancreatic cancer cells can evade immune escape.Semin Cancer Biol，2002；12：15

[20] French LE and Tschopp J.Defective death receptors signaling as a cause of Tumor immune escape.Semin Cancer Biol，2002；12：51

[21] RYU BK，Lee MG，Chi SG，et al.Increased expression of Cflipl in colonic adenocarcinoma.J Pathol，2001；194：15-19

[22] French L， Tschopp J.Inhibition of death receptor signaling by FLICE-inhibitory proteins as a meachanim for immune escape of tumors.J Exp Med.1999；190（7）891

[23] Brunner T， Kasibhatia S，Pinkoski MJ，et al.Expression of Fas ligand in activated T cells is regulated by c-Myc.J BiolChem，2000；275：9767-9772

[24] DrewaT.W 0lskiZ，Skok Z，eta1.TheFAS-related apoptosis signaling pathwayin the prostate intraepithelialneoplasia andcancerlesionsEJ3.ActaPolPharm2006：63（4）：311

[25] Protonotariou E，RizosD，M alamitsi—PuchnerA，et a1.Tissue polypeptide specificantigen and soluble Fas during normalpreg-nancyandearlylifeEJ3.InVivo，2006；20（6B）：901

[26] McVickerBI，TumaDJ，KubikJL，eta1.EthanoI-induced apoptosis in polarized hepatic cells possibly through regulation of the Fas pathway [J].Alcohol Clin Exp Res，2006；30（11）1906