固相萃取—高效液相色譜法同時(shí)測定發(fā)酵豆制品中4種大豆異黃酮

曠勇　盧成瑛　龔竹瓊　昌海

摘要[目的]采用固相萃取-高效液相色譜法同時(shí)測定大豆發(fā)酵制品中的異黃酮含量。[方法] 以乳酸、霉菌發(fā)酵大豆樣品為試材，將發(fā)酵豆制品以60%的乙醇溶液超聲波提取1 h，稀釋后用SPE小柱做凈化處理，以C18反相色譜柱（4.6 mm×250.0 mm，5.0 μm），0.2%甲酸和乙腈進(jìn)行梯度洗脫、流速為1.2 ml/min、紫外檢測波長260 nm，同時(shí)測定4種大豆異黃酮含量。[結(jié)果]試驗(yàn)得出，發(fā)酵豆制品中4種大豆異黃酮的平均回收率分別為大豆甙96.7%、染料木甙97.9%、大豆甙元102.2%、染料木素103.1%。[結(jié)論]該方法可同時(shí)測定發(fā)酵豆制品中4種大豆異黃酮成分，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好。

關(guān)鍵詞 固相萃??；高效液相色譜；發(fā)酵豆制品；大豆異黃酮

中圖分類號S509.9；O657.7+2文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2014）04-01178-03

作者簡介曠勇（1983-），男，湖南株洲人，工程師，從事天然食品添加劑產(chǎn)品研究開發(fā)。

大豆異黃酮（ISO）是大豆中的一類重要的非營養(yǎng)素成分，主要活性成分為葡萄糖甙-金雀異黃甙和大豆甙及其相應(yīng)金雀異黃素（又稱染料木素）和大豆素。經(jīng)過研究，發(fā)現(xiàn)大豆異黃酮的生理活性有抗氧化、抗腫瘤、提高雌激素水平、減少動脈硬化、改善心血管功能、抗骨質(zhì)疏松等功效[1-3]。并且有文獻(xiàn)資料指出，大豆異黃酮中異黃酮甙元比異黃酮葡萄糖甙更容易被人體吸收[4-5]，同時(shí)，異黃酮甙元具有較強(qiáng)的抗氧化活性和對癌細(xì)胞增殖的特異性抑制作用，因此異黃酮甙元被認(rèn)為是大豆異黃酮中具有預(yù)防和治療癌癥最有效的形式[6]。

發(fā)酵豆制品是湘西地區(qū)的一種傳統(tǒng)發(fā)酵食品，并且有研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵豆制品中異黃酮糖甙在微生物和酶的作用下大部分能轉(zhuǎn)化為甙元[7-8]。但發(fā)酵豆制品中大豆異黃酮的測定方法還很少，雖有研究者進(jìn)行發(fā)酵液中大豆異黃酮的糖甙類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為甙元的測定[9-10]，但由于豆制品經(jīng)發(fā)酵后成分復(fù)雜，使得樣品中雜質(zhì)去除率不高，對液相色譜柱損耗很大，并且分離度不好。筆者以乳酸、霉菌發(fā)酵大豆樣品為研究材料，選用SPE固相萃取凈化，以液相色譜梯度洗脫測定[11-13]，建立了一種分離度好、對色譜柱損耗小、能同時(shí)測定4種大豆異黃酮的檢測方法。

1 材料與方法

1.1材料樣品：經(jīng)乳酸、霉菌發(fā)酵的豆豉及發(fā)酵前原料。主要儀器：LC20A島津高效液相色譜儀；配有二極管陣列檢測器；1/100 000天平；超聲波清洗器；渦旋振蕩器；樣品搗碎機(jī)；高速離心機(jī)；固相萃取裝置。標(biāo)準(zhǔn)品：大豆甙（純度≥98%）、染料木甙（純度≥98%）、大豆甙元（純度≥98%）、染料木素（純度≥98%），上海順勃生物工程技術(shù)有限公司。主要試劑：甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、乙醇（分析純）、超純水。SPE小柱：CLEANUPCEC18156、美國SEPAX、500 mg/6 ml。

1.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 于1/100 000天平分別精密稱取大豆甙、染料木甙、大豆甙元、染料木素的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為7.37、7.73、8.77、9.22 mg，用色譜純甲醇定容至10 ml，至冰箱保存。使用時(shí)稀釋成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的制備。將發(fā)酵豆豉置于玻璃培養(yǎng)皿內(nèi)，于80 ℃烘箱烘至恒重，用組織破碎機(jī)搗碎，備用。將樣品用搗碎機(jī)搗碎，準(zhǔn)確稱取約5 g左右的粉末樣品，置于50 ml刻度試管中，先加入25 ml 60%的乙醇[14-15]，然后補(bǔ)加60%乙醇至40 ml的刻度，30 ℃，超聲1 h。將超聲好的樣液，用60%的乙醇定容至50 ml，搖勻，倒出一部分樣液于10 ml離心管，離心5 min（3 500 r/min）。準(zhǔn)確移取1 ml上清液于10 ml容量瓶，用水定容至刻度，待上柱凈化。

1.3.2 固相萃取條件的選擇。試驗(yàn)選用C18小柱做除雜的凈化處理。分別依次用純甲醇（1 ml/次）、超純水（3 ml/次）淋洗柱子，各3次，活化SPE小柱。移取5 ml稀釋樣液上柱，分別用5%、10%甲醇洗滌2次（3 ml/次），用刻度離心管收集濾出液，70 ℃氮吹，加1 ml 60%甲醇溶解，過膜待測。

另選用50%、60%甲醇洗滌2次（3 ml/次），再用純甲醇沖洗，用刻度離心管收集純甲醇濾出液，70 ℃氮吹，加1 ml 60%甲醇溶解，過膜待測。

1.3.3色譜條件。采用月旭C18反相色譜柱（4.6 mm×250.0 mm，5.0 μm），流動相為0.2%甲酸和乙腈，采用梯度洗脫，流速1.2 ml/min，洗脫程序見表1。柱溫為40 ℃，紫外檢測波長260 nm，進(jìn)樣量10 μl。

2 結(jié)果與分析

2.1色譜條件的選擇為很好地分離大豆甙和染料木甙、大豆甙元和染料木素，采用梯度洗脫程序。在洗脫條件的探索中，乙腈起始濃度分別選擇了10%、15%、18%、20% 4個濃度。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，起始乙腈濃度越低大豆甙和染料木甙分離效果越好，當(dāng)起始乙腈濃度為10%時(shí)，大豆甙和染料木甙能達(dá)到良好的基線分離，且峰形尖銳。在分離大豆甙元和染料木素時(shí)，分別選擇了乙腈漸變最大濃度為40%、45%、55%、60% 4個濃度，在乙腈濃度最大為45%時(shí)，樣品中大豆甙元和染料木素既能達(dá)到很好的基線分離，又不會過長地延遲分析時(shí)間。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制分別移取母液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml，用50%的色譜純甲醇定容至25 ml。按“1.3.3”色譜條件進(jìn)樣測定，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，回歸方程及線性范圍見表2。

2.3精密度試驗(yàn)取同一對照品溶液，按“1.3.3”色譜條件平行進(jìn)樣5次，測定4 種大豆異黃酮含量，得大豆甙、染料木甙、大豆甙元、染料木素的RSD分別為0.65%、0.51%、0.81%、0.56%，說明儀器精密度好。

2.4重復(fù)性試驗(yàn)稱取同一豆豉樣品，加入同一濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“1.3.1”和“1.3.2”樣品處理方法做5份平行樣品溶液，按“1.3.3”色譜條件進(jìn)樣，測定4 種大豆異黃酮含量，得大豆甙、染料木甙、大豆甙元、染料木素的RSD分別為1.89%、2.13%、1.25%、0.96%，說明方法重復(fù)性好。

2.5穩(wěn)定性試驗(yàn)取“2.4”重復(fù)性測試樣品溶液1份，每隔3 h進(jìn)一次樣，測定峰面積，共測定6次，計(jì)算大豆甙、染料木甙、大豆甙元、染料木素的RSD分別為1.35%、1.78%、0.88%、0.79%，說明該方法制備的溶液在18 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6檢出限該試驗(yàn)以空白試劑的3倍基線噪音（峰高）所對應(yīng)的待測組分的濃度為檢出限，計(jì)算得出大豆甙、染料木甙、大豆甙元、染料木素的檢出限分別是3.1×10-8、2.9×10-8、3.5×10-7、3.7×10-7 g/ml。

2.7固相萃取的結(jié)果在固相萃取試驗(yàn)中，分別依次選用6 ml 5%、10%甲醇溶液洗脫，測定各洗脫液中大豆甙、染料木甙、大豆甙元、染料木素含量，試驗(yàn)結(jié)果見圖1。由圖1可以看出，5%甲醇洗脫液未有大豆異黃酮洗出，10%的甲醇洗脫液中含有大豆甙、染料木甙。因此，選用5%甲醇洗脫液洗脫水溶性雜質(zhì)。

2.9發(fā)酵豆制品與豆制品原料的測定結(jié)果對比 選用8種經(jīng)乳酸、霉菌發(fā)酵的豆制品及其豆原料依據(jù)該試驗(yàn)的方法進(jìn)行測定，結(jié)果見表4?？梢钥闯觯S豆原料經(jīng)發(fā)酵后，糖甙類物質(zhì)基本轉(zhuǎn)化為甙元，發(fā)酵豆制品中甙元物質(zhì)豐富，對人體有很好的保健作用。

3 討論

發(fā)酵豆制品經(jīng)微生物降解后，雜質(zhì)多，在色譜柱上不易完全分離，且對色譜柱損耗大。該試驗(yàn)選用固相萃取，能很好地除去樣品中的雜峰，使樣品中目標(biāo)成分能很好地分離，同時(shí)降低液相色譜柱的使用損耗。該試驗(yàn)采用梯度洗脫同時(shí)測定4種大豆異黃酮，能很好地分離大豆甙與甙元，為準(zhǔn)確測定4種大豆異黃酮提供了檢測依據(jù)。

通過對發(fā)酵豆制品在發(fā)酵前后的對比測定表明，豆制品經(jīng)發(fā)酵后，糖甙類物質(zhì)能很好地轉(zhuǎn)化為甙元，更容易被人體吸收，是一類很好的保健食品。

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