硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基成分、歷史起源及應(yīng)用研究進(jìn)展

王似錦，高 春

（北京市藥品檢驗(yàn)所，北京 100035）

Brewer于1940年發(fā)明了硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（Fluid Thioglycollate Medium），在此后的20余年中，該培養(yǎng)基的配方逐漸被固定下來。自20世紀(jì)50年代起，國(guó)內(nèi)外藥典陸續(xù)將其收錄，用于藥品的無菌檢查。研究人員發(fā)現(xiàn)，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基存在一定的局限性，20世紀(jì)60年代，陸續(xù)有報(bào)道表明該培養(yǎng)基并不能使所有的梭狀芽孢桿菌生長(zhǎng)，并提出應(yīng)同時(shí)使用TSA培養(yǎng)基作為補(bǔ)充，隨后這一建議被國(guó)外藥典采納。但該培養(yǎng)基之所以能夠沿用至今，是因?yàn)槠渚哂胁豢商娲木薮髢?yōu)勢(shì)，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基能在普通有氧環(huán)境下提供厭氧條件，使需氧菌和厭氧菌均能夠生長(zhǎng)良好，并易于觀察結(jié)果，這提供了一般實(shí)驗(yàn)室難以達(dá)到的厭氧培養(yǎng)條件?，F(xiàn)就其成分、歷史起源、應(yīng)用進(jìn)展綜述如下。

1 成分分析

硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基收載于2010年版《中國(guó)藥典》無菌檢查附錄項(xiàng)[1]下，用于藥品的無菌檢查。該培養(yǎng)基的配方見表1。

表1 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基的配方

1)碳源和氮源

酪胨（胰酶水解）和 L － 胱氨酸〔HOOC(NH2)CHCH2〕S2[2]：酪胨是由酪蛋白經(jīng)過胰酶水解后，將大分子的酪蛋白分解為目示、胨、肽及多種氨基酸。由于原材料是從奶中提取的酪蛋白，質(zhì)量穩(wěn)定，氨基酸種類多，優(yōu)于一般的胨，與L－胱氨酸構(gòu)成細(xì)菌成長(zhǎng)所需的氮源。

葡萄糖[2]：提供微生物生長(zhǎng)所需的碳源。自然界中大多數(shù)微生物都能利用葡萄糖，由于細(xì)菌代謝過程中分解代謝葡萄糖產(chǎn)酸，培養(yǎng)及加熱滅菌時(shí)葡萄糖被破壞會(huì)產(chǎn)生有毒物質(zhì)，因此應(yīng)注意其用量及加熱次數(shù)。

酵母浸出粉[2]：酵母浸出粉是由氨基酸類、肽類、水溶性維生素及酵母多糖、酵母核酸組成的一種混合物，還含有豐富的B族維生素和各種氨基酸。核苷酸類、有機(jī)酸類、礦物質(zhì)類及維生素類的水溶性物質(zhì)。不僅能補(bǔ)充氮源，還能提供微生物生長(zhǎng)的各種維生素及氨基酸。

2)無機(jī)鹽類

氯化鈉、酪胨、酵母浸出粉中含有的 PO43－，NH4＋，Mg2＋，Ca2＋，SO42－、Fe3＋，Cu2＋等無機(jī)離子，構(gòu)成細(xì)菌細(xì)胞的組織物質(zhì)，具有影響酶活性及調(diào)節(jié)滲透壓的作用[2]。

3)厭氧（還原）環(huán)境的形成與保持

硫乙醇酸鈉〔HSCH2COONa〕或硫乙醇酸〔HSCH2COOH〕：在培養(yǎng)基中的主要作用有兩方面，一是與 L－胱氨酸、葡萄糖有降低氧化還原電位的作用，使深部氧化還原電位較低。Reed等[3]的報(bào)道表明，硫乙醇酸鈉的存在使培養(yǎng)基的上部電位約為＋0．2～＋0．1 V，下部電位約為 ＋0．1～0 V，管底部約為 －0．3～ －0．2 V，因而維持培養(yǎng)基下層的厭氧條件，有利于厭氧菌的生長(zhǎng)。二是具有鈍化砷和汞類藥物及防腐劑的抑菌作用[4]。當(dāng)汞鹽等物質(zhì)存在時(shí)，它與培養(yǎng)基中的SH基結(jié)合，抑制了細(xì)菌的生長(zhǎng)。當(dāng)培養(yǎng)基中有硫乙醇酸鹽時(shí)，培養(yǎng)基內(nèi)SH基增多，消除汞鹽等抑菌現(xiàn)象，有利于細(xì)菌的生長(zhǎng)。

瓊脂[4]：在培養(yǎng)基中加入少量瓊脂，可減少液面流動(dòng)，降低氧的吸收，維持培養(yǎng)基底部的還原電位，有利于厭氧菌的生長(zhǎng)。但應(yīng)選用透明度好的瓊脂，以免影響判斷結(jié)果。

4)氧化還原指示劑

刃天青（resazurin）或亞甲藍(lán)（methylene blue）[2]為氧化還原指示劑，新鮮制備的培養(yǎng)基，溫度較高，培養(yǎng)基管的上部與氧接觸，刃天青呈藍(lán)色，而中下部培養(yǎng)基呈無氧狀態(tài)，刃天青還原為無色，當(dāng)培養(yǎng)基放置后，培養(yǎng)基與空氣接觸，有溶氧，刃天青被氧化，變?yōu)榉奂t色。當(dāng)培養(yǎng)基量氧化層的高度超過1／5時(shí)，可在水浴中煮沸至粉紅色消失，為防止培養(yǎng)基成分分解，煮沸時(shí)間不宜過長(zhǎng)，不得超過20 min，并只能加熱1次[1]。

2 歷史起源與發(fā)展

早在1898年，Trenkmann[5]就報(bào)道在堿性硫化物的培養(yǎng)基中厭氧菌可在有氧環(huán)境中生長(zhǎng)。1926年，Quastel等[6]發(fā)現(xiàn)，在有氧環(huán)境生孢羧菌能在一些含巰基（－SH）的化合物（如半胱氨酸，硫乙醇酸，谷胱甘肽）存在的胰酪蛋白消化肉湯中生長(zhǎng)。

1938年，Carolyhn等[7]研究了在生物制品污染物的檢驗(yàn)中，培養(yǎng)基中瓊脂的濃度對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響。其研究表明，在生物制品的無菌檢查中，含有低濃度瓊脂（0．06% ～0．25%）的培養(yǎng)基在檢驗(yàn)過程中表現(xiàn)出更大的優(yōu)勢(shì)。

1940年，Brewer[8]總結(jié)了前人在培養(yǎng)基中使用還原劑和瓊脂的優(yōu)勢(shì)，發(fā)明了1種能在有氧條件下培養(yǎng)厭氧菌和需氧菌的澄清的液體培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含0．05%的瓊脂，無論含與不含硫乙醇酸鈉（sodium thioglycollate），均能使厭氧菌生長(zhǎng)。這就是硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基的前身。

1940年，Marshall等[9]報(bào)道了在Brewer的硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基中有汞防腐劑存在的情況下，厭氧菌能生長(zhǎng)良好。

1941年，Linden[10]對(duì)其進(jìn)行了改進(jìn)，增加了蛋白胨的量，加入了酵母浸出物（yeast extract）代替牛肉浸出物(meat broth)，后人將其改進(jìn)的培養(yǎng)基命名為 Brewer－Linden培養(yǎng)基（Brewer－Linden medium）。

1942年，Reed等[2]通過在硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中培養(yǎng)厭氧菌，來研究培養(yǎng)基中各組分對(duì)氧化還原電勢(shì)的影響。結(jié)果表明，最佳電勢(shì)是－0．2 V，葡萄糖對(duì)培養(yǎng)基中的氧化還原電勢(shì)影響不大，硫乙醇酸鹽、半胱氨酸對(duì)保證培養(yǎng)基的氧化還原電勢(shì)發(fā)揮了重要作用，微量的瓊脂增加了其還原環(huán)境的穩(wěn)定性。

1943年，Nungester等[11]和 Portwood[12]證明了硫乙醇酸鹽對(duì)含汞防腐劑的中和作用。

1945年，Pittman[13]總結(jié)了 Brewer和Linden關(guān)于硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基的配方，對(duì)其中的主要配方進(jìn)行了逐一研究。其研究表明，與甲基藍(lán)相比，刃天青是一個(gè)良好的氧化還原指示劑，濃度在百萬分之一既能充分發(fā)揮其氧化還原的指示功能，又對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)沒有影響。與酸化水解酪蛋白（acid hydrolyzate of casein）相比，胰酶消化酪蛋白（pancreatic digest of casein）有更好的促生長(zhǎng)特性。水溶性的酵母浸出物也有促生長(zhǎng)作用。酵母浸出物和胰酶消化酪蛋白的最佳濃度為0．5%和1．5%。在細(xì)菌生長(zhǎng)初期，磷酸二氫鉀有延緩生長(zhǎng)的作用。氯化鈉的濃度為0．25%，培養(yǎng)基的pH為7．1，為細(xì)菌最合適的生長(zhǎng)條件。在培養(yǎng)基中添加 L－半胱氨酸能使鳴疽梭狀芽胞桿菌生長(zhǎng)，他的建議被USP（1955）采納，并一直沿用至今。在他1946年的報(bào)道中，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基各成分與現(xiàn)今包括《中國(guó)藥典》在內(nèi)的世界上大多數(shù)國(guó)家的藥典處方基本一致。

1959年，Zdenka[14]比較了前人用于生物制品無菌檢查的5種培養(yǎng)基，其中包括USPXV中規(guī)定的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基、USPXV中規(guī)定的肝肉湯培養(yǎng)基、Linden改進(jìn)Brewer的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，Clausen的改良次硫酸鹽培養(yǎng)基，Bonnel的次硫酸鹽培養(yǎng)基。結(jié)果表明，USPXV中規(guī)定的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和Clausen的改良次硫酸鹽培養(yǎng)基得到了最好的結(jié)果。

3 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基的局限性

雖然大量的研究和報(bào)道證明，該培養(yǎng)基可同時(shí)培養(yǎng)需氧菌和厭氧菌。但20世紀(jì)60年代，有研究報(bào)道表明該培養(yǎng)基對(duì)一些梭狀芽孢桿菌有抑制作用。

1968年，Mossel等[15]報(bào)道，硫乙醇酸鹽對(duì)來自8個(gè)菌屬14株梭狀芽孢桿菌的孢子有不同程度的抑制作用。

1970年，Hibbert等[16]研究了含硫乙醇酸鈉濃度為 0～0．05%的培養(yǎng)基對(duì)4株梭狀芽孢桿菌回收率的影響。結(jié)果表明，0．01%濃度的硫乙醇酸鈉對(duì)梭狀芽孢桿菌有一定抑制作用，抑制作用還受到培養(yǎng)基中其它成分的影響，比如葡萄糖的存在就可以顯著地降低其抑制作用。

1968年，Doyle等[17]的研究表明，一些暴露于環(huán)氧乙烷氣體的枯草芽胞桿菌黑色變種芽胞在硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)，此外，TSA（大豆酪蛋白瓊脂）培養(yǎng)基能夠得到更高的回收率。該研究最后提出在使用硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基的同時(shí)，可同時(shí)使用TSA培養(yǎng)基作為補(bǔ)充。

4 國(guó)內(nèi)研究現(xiàn)狀

4．1 中國(guó)藥典收載情況

1977年版《中國(guó)藥典》[18]無菌檢查項(xiàng)下，將硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基作為選擇性培養(yǎng)基列入，并注明用于汞砷類化合物的無菌檢查。1985年版《中國(guó)藥典》[19]，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基收載于無菌檢查項(xiàng)下，培養(yǎng)基的名稱為“需氧、厭氣菌培養(yǎng)基”。在此后的各版《中國(guó)藥典(一部、二部、三部)》及《中國(guó)生物制品規(guī)程》，均收載硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基用于無菌檢查。

4．2 在藥品控制菌檢查中的應(yīng)用

硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基具有中和汞砷等防腐劑的作用，因此一些報(bào)道將其用于藥品的控制菌檢查，以消除藥品的抑菌作用。騰寶霞等[20]就報(bào)道了該培養(yǎng)基用于藥品的大腸桿菌的檢查，與膽鹽乳糖培養(yǎng)基相比，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基可用于抑菌作用較強(qiáng)的樣品的大腸桿菌檢查。杜蕓[21]報(bào)道了硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基在外用藥品金黃色葡萄球菌檢查中的應(yīng)用，其研究結(jié)果表明，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基有消除部分外用藥品對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用，其陽性生長(zhǎng)率比營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基高出19個(gè)百分點(diǎn)。

4．3 作為氧化還原指示劑的應(yīng)用

郭惠文等[22]報(bào)道，用硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基作為厭氧罐厭氧狀態(tài)的指示劑，并采用厭氧罐進(jìn)行了生孢梭菌菌懸液的培養(yǎng)計(jì)數(shù)。

代淑艷等[23]研究了刃天青在硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中的氧化還原指示劑的作用，其研究用厭氧菌生孢梭狀芽孢桿菌、需氧菌短芽孢桿菌及乙型溶血性鏈球菌進(jìn)行靈敏度檢查。結(jié)果表明，不同刃天青含量與未加刃天青、煮沸驅(qū)氧與未驅(qū)氧的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基的靈敏度無明顯差異。

4．4 靈敏度檢查

高尚先等[24]報(bào)道，中國(guó)藥品生物制品檢定所等5家科研單位對(duì)硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基進(jìn)行了靈敏度檢查的驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果表明，當(dāng)接種生孢梭菌、乙型溶血性鏈球菌、短芽孢桿菌的平皿CFU計(jì)數(shù)在10～100 cfu／mL時(shí)，接種個(gè)質(zhì)控菌的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基均呈現(xiàn)生長(zhǎng)，表明該靈敏度檢查方法準(zhǔn)確性、可操作性和重復(fù)性良好，易于推廣和實(shí)施。

4．5 配置和使用注意事項(xiàng)

2010年版《中國(guó)藥典》附錄無菌檢查項(xiàng)下規(guī)定[1]，在分裝至適宜容器中，其裝量與容器高度的比例應(yīng)符合培養(yǎng)結(jié)束后培養(yǎng)基氧化層（粉紅色）不超過培養(yǎng)基深度的1／2。在供試品接種前，培養(yǎng)基氧化層的高度不得超過培養(yǎng)基深度的1／5。否則，須經(jīng)100℃水域加熱至粉紅色消失（不超過20 min）迅速冷卻，只限加熱1次，并防止被污染。該培養(yǎng)基不宜放置過長(zhǎng)時(shí)間，以防止培養(yǎng)基氧化層深度增加，從而使培養(yǎng)基底層失去厭氧環(huán)境。使用前，應(yīng)按照《中國(guó)藥典》的要求進(jìn)行靈敏度試驗(yàn)，只有通過靈敏度試驗(yàn)的培養(yǎng)基才能夠用于無菌檢查。

5 結(jié)語

約100年前，世界范圍內(nèi)的微生物學(xué)家在尋找一個(gè)能夠同時(shí)培養(yǎng)需氧菌和厭氧菌的，并能在有氧環(huán)境中使用的培養(yǎng)基。經(jīng)過約40年的努力，Brewer于1940年發(fā)明了硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基。在此后的20余年中，經(jīng)過大量研究，該培養(yǎng)基的配方逐漸被固定下來。自20世紀(jì)50年代起，國(guó)內(nèi)外藥典陸續(xù)將其收錄，用于藥品的無菌檢查。

在使用過程中，研究人員發(fā)現(xiàn)硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基存在一定的局限性，20世紀(jì)60年代，陸續(xù)有報(bào)道表明該培養(yǎng)基并不能使所有的梭狀芽孢桿菌生長(zhǎng)，并提出應(yīng)同時(shí)使用TSA培養(yǎng)基作為補(bǔ)充，隨后這一建議被國(guó)外藥典采納。但該培養(yǎng)基之所以能夠沿用至今，是因?yàn)槠渚哂胁豢商娲木薮髢?yōu)勢(shì)：硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基能夠在普通有氧環(huán)境下提供厭氧條件，使需氧菌和厭氧菌均能夠生長(zhǎng)良好，并易于觀察結(jié)果，這提供了一般實(shí)驗(yàn)室難以達(dá)到的厭氧培養(yǎng)條件。

綜上所述，該培養(yǎng)基的使用，能夠確保藥品無菌檢查在基層實(shí)驗(yàn)室中的順利進(jìn)行，并仍將在藥品檢驗(yàn)過程中發(fā)揮其不可替代的重要作用。

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