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    中江縣丹參連作土壤細(xì)菌多樣性研究

    2019-04-26 07:28:38王強(qiáng)鋒劉軼豪張凌子
    關(guān)鍵詞:根際條帶丹參

    陳 章,王強(qiáng)鋒,陳 強(qiáng),劉軼豪,張凌子

    ( 1. 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)信息與農(nóng)村經(jīng)濟(jì)研究所,四川 成都 610066; 2. 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)核技術(shù)研究所,四川 成都 610066; 3. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)資源學(xué)院,四川 溫江 611130)

    【研究意義】丹參(SalviamiltiorrhizaBge)為多年生草本唇形科鼠尾草屬植物,以根入藥,對(duì)心血管系統(tǒng)疾病療效顯著,是四川的主要道地中藥材[1]。近年來,隨著中醫(yī)藥大健康產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,丹參人工栽培面積快速擴(kuò)大,但連作障礙卻成為制約優(yōu)質(zhì)丹參生產(chǎn)的重要因素,因此亟需解決連作難題,促進(jìn)丹參產(chǎn)業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展。【前人研究進(jìn)展】王剛云和李先恩等[2-3]研究表明,大部分丹參連作障礙的發(fā)生與多種病原菌有關(guān),且屬于土傳病害。近年來對(duì)丹參的研究,主要集中于丹參栽培,包括種植方式與密度[4]、生防菌劑應(yīng)用與丹參品質(zhì)[5-7],連作土壤浸提物變化[8-9],以及丹參輪作[10-11]和丹參不同連作年限的土壤微生物變化[12-14]等方面。目前僅有少許研究丹參連作過程中正常生長(zhǎng)丹參根際與非根際土壤、患病丹參根際與非根際土壤真菌類群差異[12],但細(xì)菌類群變化未見報(bào)道?!颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本論文采用可培養(yǎng)技術(shù)和PCR-DGGE技術(shù),開展丹參GMP基地連作土壤細(xì)菌群落特征研究,旨在弄清楚丹參連作根際和非根際土壤細(xì)菌群落變化,為進(jìn)一步解決丹參連作障礙提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 土壤樣品的采集

    采樣點(diǎn)在四川省中江縣石泉鄉(xiāng)GMP丹參種植基地,土壤類型為石灰性紫色土壤,土壤丹參連作8年。分別采集正常生長(zhǎng)和患病丹參各10株連同植株與土壤一起裝入無菌采樣袋中帶回實(shí)驗(yàn)室。按照患病丹參根際(HD1)和非根際(HD2),正常生長(zhǎng)丹參根際( CK1)和非根際(CK2)收集土樣。

    1.2 可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性

    1.2.1 土壤細(xì)菌的分離 采用稀釋涂布平板法[15]。將土壤制成10-1~10-7系列稀釋懸液,取10-5、10-6、10-7梯度,采用牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基平板表面涂布,37 ℃培養(yǎng)2~3 d,挑取單個(gè)菌落進(jìn)行劃線純化,結(jié)合鏡檢獲得供試細(xì)菌純培養(yǎng),牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面保存4 ℃冰箱備用。

    1.2.2 菌株DNA提取 將純化的菌株接種至牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中,28 ℃,150 r·min-1振蕩培養(yǎng)8 h。將菌液轉(zhuǎn)移至1.5 mL的EP管,4 ℃、10 000 r·min-1離心2 min,棄上清液,加入200 μl 1×TE緩沖液,再加入2 μl 20 mg·mL-1的溶菌酶和2 μl 10 mg·mL-1的蛋白酶K,37 ℃水浴1 h,后續(xù)步驟參照陳強(qiáng)等[16]的方法。

    1.2.3 16S rDNA PCR-RFLP分析 16S rDNA序列擴(kuò)增引物及反應(yīng)體系參見文獻(xiàn)[17]。PCR產(chǎn)物用4種限制性內(nèi)切酶HaeⅢ、HinfⅠ、MspⅠ及TaqⅠ在37 ℃(TaqⅠ在65 ℃)酶切8 h。酶切反應(yīng)體系為10 μl,其中包括1 μl酶(10 U·μl-1),1 μl 10×Buffer,1 μl BSA(1 mg·mL-1),5 μl 16S rDNA的PCR產(chǎn)物和2 μl ddH2O。酶切產(chǎn)物用2 %的瓊脂糖凝膠在80 V電壓條件電泳分離2.5 h,使用凝膠成像系統(tǒng)拍照,圖譜采用NTSYS軟件,用非加權(quán)平均連鎖法(UPGMA)進(jìn)行聚類分析[12]。

    1.2.4 16S rDNA序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 采用生物瓊脂糖凝DNA膠回收試劑盒(EZ-10 Spin Column PAGE Gel DNA Extraction Kit)對(duì)已擴(kuò)增的16S rDNA PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化,純化后送生基因測(cè)序公司測(cè)序。在NCBI中將菌株16S rDNA序列BLAST比對(duì),取與之相似的菌株16S rDNA序列,用MEGA 5.1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[18]。

    1.3 免培養(yǎng)細(xì)菌多樣性

    1.3.1 土壤總DNA提取 參見文獻(xiàn)[12],土樣加入9 mL DNA 提取液混勻,再加入450 μl 溶菌酶(20 mg·mL-1),37 ℃水浴30 min,其間搖動(dòng)數(shù)次;然后加入50 μl蛋白酶K (10 mg·mL-1),37 ℃水浴30 min,后續(xù)步驟參見Zhou 等[19]的方法進(jìn)行。

    1.3.2 PCR-DGGE 采用嵌套式PCR擴(kuò)增,第一輪: 進(jìn)行16S rDNA序列擴(kuò)增[17],然后用特異引物GC-F984/R1378擴(kuò)增第二輪獲得大約430 bp的片段用于DGGE分析[20]。

    取20 μl第2輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行DGGE,采用Bio-Rad公司的DcodeTM基因突變檢測(cè)系統(tǒng),DGGE參數(shù)為:8 %聚丙烯酰胺凝膠,變性劑濃度梯度35 %~65 %,150 V電壓下預(yù)電泳10 min,隨后在85 V的固定電壓,60 ℃下電泳11 h。電泳結(jié)束后銀染[21],條帶克隆測(cè)序。

    1.3.3 DGGE圖譜分析 DGGE圖譜采用Bio-rad的Quantity One分析軟件進(jìn)行微生物多樣性分析[22]。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性

    從供試丹參種植土壤共分離出46株細(xì)菌純培養(yǎng)物,其中正常生長(zhǎng)丹參根際土壤(CK1)17株,正常生長(zhǎng)丹參非根際土壤(CK2)8株;患病丹參根際土壤(HD1)12株,患病丹參非根際土壤(HD2)9株。菌株編號(hào)ZJZG代表正常根際土壤(CK1),ZJZF代表正常非根際土壤(CK2),ZJHG代表患病根際土壤(HD1),ZJHF代表患病非根際土壤(HD2)。從丹參根際土壤分離的可培養(yǎng)細(xì)菌高于非根際土壤,說明根系分泌物對(duì)土壤細(xì)菌有較大的影響。

    提取土壤基因組DNA,1 %瓊脂糖凝膠電泳分析,條帶清晰、整齊,無拖尾現(xiàn)象,說明土壤DNA提取質(zhì)量較高。以土壤細(xì)菌基因組DNA為模板擴(kuò)增16S rDNA片段,獲得1500 bp的特異性片段。酶切圖譜進(jìn)行聚類分析,在50 %的水平上,全部菌株聚在一起;在79 %相似水平處,全部供試菌株被分成分為7個(gè)遺傳群(圖1),其中,ZJHF06,ZJHG09,ZJHF09 和ZJZF04分別單獨(dú)成群;群Ⅰ由來源于4種土樣的27個(gè)菌株組成; ZJHF08,ZJHG06,ZJHG07組成群Ⅲ; ZJZG06和ZJZG10組成群Ⅵ。從4種土壤中分離的細(xì)菌,既有細(xì)菌處于同一個(gè)遺傳群,也有細(xì)菌構(gòu)成特有的遺傳群。

    選取12個(gè)細(xì)菌為代表菌株,其16S rDNA構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹形成了5個(gè)分支(圖2)。分支1為芽孢桿菌屬(Bacillus),分支2為短桿菌屬(Brevibacterium),分支3為拜葉林克氏菌屬(Beijerinckia),分支4為假單胞菌屬(Pseudomonas)??梢?,中江丹參連作土壤細(xì)菌主要類群為芽孢桿菌屬細(xì)菌(Bacillus)。不同生長(zhǎng)狀態(tài)的丹參土壤,可培養(yǎng)細(xì)菌也表現(xiàn)出了差異,其中,短桿菌屬和拜葉林克氏菌屬出現(xiàn)在患病根際土壤;而假單胞菌屬出現(xiàn)在丹參正常生長(zhǎng)的根際和非根際土壤。

    圖1 細(xì)菌16S rDNA PCR-RFLP UPGMA 樹狀圖Fig.1 UPGMA dendrogram generated from the positive bacteriaof 16S rDNA PCR-RFLP

    2.2 免培養(yǎng)細(xì)菌多樣性

    2.2.1 土壤總DNA提取及16S rDNA擴(kuò)增 土壤總DNA純化后,經(jīng)0.8 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),大于23 kb,條帶清晰、整齊,無拖尾現(xiàn)象,質(zhì)量較好。土壤總DNA經(jīng)過巢式PCR,第一輪獲得大小約1500 bp的16S rDNA片段,陰性對(duì)照無擴(kuò)增條帶,第二輪獲得約430 bp的片段,與預(yù)期一致。

    2.2.2 DGGE圖譜分析 變性梯度凝膠電泳結(jié)果表明,不同樣品間DGGE條帶強(qiáng)度和遷移位置都有所不同(圖3)?;疾〉⒏H土壤(HD1)與其他土壤的條帶差異很大。其中,相比正常生長(zhǎng)丹參根際土壤(CK1),條帶XB2,XB3,XB4,XB5為患病丹參根際土壤(HD1)所特有,而XA1,XD6,XD7為其它3種土樣所特有,這說明患病丹參根際土壤細(xì)菌類群發(fā)生較大變化。

    采用UPGMA對(duì)供試土壤DGGE圖譜進(jìn)行聚類(圖4),供試樣品形成3個(gè)分支,CK1和CK2為1個(gè)分支,與患病丹參土壤樣品HD1和HD2明顯分離開。正常生長(zhǎng)和患病丹參種植土壤,不同土壤樣品的DGGE條帶存在差異,說明丹參種植過程中,根際與非根際細(xì)菌類群發(fā)生了顯著變化,尤其是患病丹參的根際和非根際差異極大,表明其細(xì)菌類群在連作過程中已經(jīng)發(fā)生較大的變化。

    圖2 代表菌株的16S rDNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of 16S rDNA sequences of the representative isolates

    圖3 土壤細(xì)菌PCR-DGGE圖譜Fig.3 PCR-DGGE profiles of the soil bacterial community

    圖4 土壤細(xì)菌DGGE條帶圖譜聚類分析Fig.4 Cluster analysis based on DGGE bands profiles

    2.2.3 DGGE條帶克隆測(cè)序分析 選取7個(gè)典型DGGE條帶進(jìn)行克隆測(cè)序,絕大多數(shù)條帶為未培養(yǎng)細(xì)菌(Uncultured bacterium),占所有條帶的71.43 %;僅有2個(gè)條帶為可培養(yǎng)菌,條帶XB2代表了可培養(yǎng)的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum),條帶XB3代表了為可培養(yǎng)的堅(jiān)強(qiáng)腸球菌(Enterococcusdurans),其相似性達(dá)99 %(表1)。

    表1 DGGE條帶的序列相似性比對(duì)

    3 討 論

    盡管傳統(tǒng)的板分離技術(shù)只能獲得環(huán)境微生物總數(shù)的0.1 % ~10.0 %[23],不利于研究環(huán)境樣品的微生物多樣性,但稀釋平板法可通過分離、純化得到純菌株,鑒定明確分類地位,這對(duì)于弄清不同種植方式對(duì)丹參土壤細(xì)菌群落的影響具有積極意義。本研究分離獲得的46個(gè)菌株,雖然只分布在芽孢桿菌屬(Bacillus)、短桿菌屬(Brevibacterium)、拜葉林克氏菌屬(Beijerinckia)和假單胞菌屬(Pseudomonas),但研究結(jié)果較好地揭示出了不同處理間細(xì)菌種群差異,且以芽孢桿菌為優(yōu)勢(shì)種群,這有助于進(jìn)一步篩選促進(jìn)丹參生長(zhǎng)的有益菌株。

    與此同時(shí),應(yīng)用PCR-DGGE免培養(yǎng)技術(shù)分析了土壤細(xì)菌群落,其結(jié)果顯示,PCR-DGGE結(jié)果與純培養(yǎng)結(jié)果完全不同,代表性條帶大多為不可培養(yǎng)細(xì)菌,僅有2個(gè)條帶代表了可培養(yǎng)的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum),堅(jiān)強(qiáng)腸球菌(Enterococcusdurans),而這2個(gè)菌株未在純培養(yǎng)物中出現(xiàn)。相關(guān)研究表明,植物在連作過程中,其根系分泌物和殘落物亦會(huì)對(duì)根際微生物群落產(chǎn)生影響[26-27]。PCR-DGGE能較好地反映丹參患病土壤和正常土壤細(xì)菌類群的差異,盡管大多數(shù)條帶都是未鑒定細(xì)菌(Uncultured bacterium),這與林貴兵的研究相似[11],也說明丹參連作障礙的發(fā)生機(jī)理極為復(fù)雜。

    4 結(jié) 論

    本研究表明,不同的丹參種植土壤樣品間,既有分類地位相同的細(xì)菌種類存在,也有各自特有的細(xì)菌種群,這為進(jìn)一步探明丹參連作障礙發(fā)生機(jī)理,進(jìn)而控制連作障礙提供微生物學(xué)理論依據(jù)。

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