厚樸四君子湯顆粒的HPLC指紋圖譜及其與組方藥材的相關(guān)性研究

楊小秋，羅文匯，董玉娟，彭麗詩,許燦新

(1.深圳市南山區(qū)西麗人民醫(yī)院，廣東 深圳 518055；2.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院，廣東 廣州 510095；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510405)

?

厚樸四君子湯顆粒的HPLC指紋圖譜及其與組方藥材的相關(guān)性研究

楊小秋1，羅文匯2*，董玉娟3，彭麗詩3,許燦新3

(1.深圳市南山區(qū)西麗人民醫(yī)院，廣東 深圳 518055；2.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院，廣東 廣州 510095；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510405)

目的：建立厚樸四君子湯顆粒的指紋圖譜，為該制劑的質(zhì)量控制提供實驗基礎(chǔ)。方法：采用高效液相色譜法，以SHISEIDO Capcell park MC C18(4.6mm×250mm，5μm) 為色譜柱；以甲醇 (A)-0.1%(體積分數(shù))磷酸(B)為流動相進行梯度洗脫；檢測波長240nm；流速1.0mL·min-1；柱溫30℃,建立厚樸四君子湯顆粒的HPLC指紋圖譜共有模式，并對色譜峰進行歸屬分析。結(jié)果：確定了24個共有峰，10批樣品相似度均在0.9以上，其中20個色譜峰分別溯源到厚樸、人參、白術(shù)、茯苓和甘草五味藥材，4個色譜峰可明確化學(xué)成分的歸屬。結(jié)論：該實驗建立的HPLC指紋圖譜體現(xiàn)了厚樸四君子湯顆粒的整體特征，能有效地對其質(zhì)量進行評價。

厚樸四君子湯顆粒；指紋圖譜；高效液相色譜

厚樸四君子湯由厚樸加四君子湯組成?！八木訙睘椤短交菝窈蛣┚址健返慕?jīng)典方，由人參、茯苓、白術(shù)、甘草組成，具有補氣、健脾、利濕之功效，是中醫(yī)治療脾胃氣虛、運化無力的常用方劑，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)常用于慢性胃炎、胃及十二指腸球部潰瘍等屬脾胃氣虛型疾病的治療[1]。根據(jù)臨床常見慢性胃炎患者大多有食積氣滯、脘腹脹悶或腹痛、泄瀉等的癥狀，在“四君子湯”的基礎(chǔ)上加具有行氣化濕、溫中止痛的厚樸，稱之為“厚樸四君子湯”。厚樸四君子湯顆粒具有行氣化濕止痛、益氣健脾之功效，現(xiàn)代臨床多用于治療慢性胃炎、胃及十二指腸球部潰瘍等屬脾胃氣滯、氣虛證。

本研究在前期探討了厚樸四君子湯治療慢性胃炎的藥效作用[2]，為了更好地控制厚樸四君子湯顆粒的質(zhì)量，采用高效液相色譜法構(gòu)建厚樸四君子湯及各單味藥指紋圖譜，并對組方藥材與顆粒之間的相關(guān)性進行研究，同時對色譜峰進行歸屬，以期為厚樸四君子湯的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695-2998型高效液相色譜儀(美國沃特斯公司，PAD檢測器，四元梯度泵)，軟件為Empower 2 數(shù)據(jù)處理軟件系統(tǒng)；SHISEIDO Capcell park MC C18(4.6 mm×250 mm，5μm) 色譜柱；KQ5200DE 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Mettler XS205DU 電子天平(瑞士梅特勒托利多公司)；MilliPoreAdvantage A10 自動純水機(美國默克密理博公司)。

1.2 試藥

厚樸四君子湯顆粒由深圳市南山區(qū)西麗人民醫(yī)院提供，批號見表1。厚樸、人參、茯苓、白術(shù)、甘草藥材均購于安徽廣印堂制藥有限公司，經(jīng)劉法錦研究員鑒定：厚樸為木蘭科植物厚樸MagnoliaofficinalisRehd.et Wils.的干燥干皮、根皮及枝皮；人參為五加科植物人參PanaxginsengC.A.Mey.的干燥根和根莖；白術(shù)為菊科植物白術(shù)AtractylodesmacrocephalaKoidz.的干燥根莖；茯苓為多孔菌科茯苓Poriacocos(Schw.) Wolf的干燥菌核；甘草為豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根及根莖。甘草苷對照品(批號：111610-201005)、甘草酸銨(批號：110731-200615)、厚樸酚(批號：729-9204)、和厚樸酚(批號：730-9204)均購于中國食品藥品檢定研究院。

甲醇、乙腈為色譜純(美國默克公司)；液相用水為超純水；其余試劑均為分析純。

表1 厚樸四君子湯顆粒測試樣品批號

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：SHISEIDO Capcell park MC C18(4.6mm×250mm，5μm) ；流動相：以甲醇為流動相A，0.1%(體積分數(shù))磷酸的水溶液為流動相B，按表2程序，進樣測定。檢測波長：240nm；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃。

表2 流動相梯度洗脫條件

2.2 對照品溶液制備

分別精密稱取甘草苷、甘草酸銨、厚樸酚和和厚樸酚對照品適量，置100mL容量瓶中，加甲醇分別制成每1mL含甘草苷0.101mg、甘草酸銨0.1664mg、厚樸酚0.5378mg和和厚樸酚0.6012mg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液制備

分別取上述S1～S10厚樸四君子湯顆粒各約2.0g，精密稱定，置100mL具塞錐瓶中，精密加入50%甲醇25mL，稱定重量，超聲處理(功率200W，頻率40kHz)30min。取出，放冷，再稱定重量，加50%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 厚樸四君子湯顆粒組方藥材供試品溶液制備

分別取與顆粒投料同批藥材，厚樸藥材粉末1.5g、人參藥材粉末3.0g、白術(shù)藥材粉末2.0g、茯苓藥材粉末5.0g、甘草0.5g，精密稱定，加水100mL，煮沸30min，蒸干，加硅藻土1.0g拌勻，同“2.3”項方法制成厚樸四君子湯顆粒組方藥材供試品溶液。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗 取同一批厚樸四君子湯顆粒(批號：J130805)，按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，連續(xù)進樣6次，按“2.1”項下條件測定。以9號峰為參照峰，其保留時間和峰面積為1，計算出各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果其RSD值均小于3%，同時用相似度評價軟件計算各指紋圖譜的相似度均大于0.99，表明儀器精密度良好。

2.5.2 重復(fù)性試驗 取同一批厚樸四君子湯顆粒(批號：J130805)，分別精密稱取6份，按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下條件測定。以9號峰為參照峰，其保留時間和峰面積為1，計算出各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值均小于3%，同時用相似度評價軟件計算各指紋圖譜的相似度均大于0.99，表明本方法重復(fù)性良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗 取同一批厚樸四君子湯顆粒(批號：J130805)，分別于制備后0、4、8、12、16、24h進樣，按“2.1”項下條件測定。以9號峰為參照峰，計算出各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值均小于3%，同時用相似度評價軟件計算各色譜指紋圖譜的相似度均大于0.99，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 厚樸四君子湯顆粒HPLC指紋圖譜的建立

2.6.1 厚樸四君子湯顆粒對照指紋圖譜的建立及特征峰的指認 采用藥典委員會推薦的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004A版)對10批厚樸四君子湯顆粒HPLC圖譜進行處理，匹配結(jié)果見圖1，所得對照指紋圖譜見圖2。選擇穩(wěn)定性好、吸收較強、特征明顯的色譜峰為共有峰，根據(jù)10批樣品的測定結(jié)果確定24個共有峰。經(jīng)與對照品溶液色譜圖比對后，確認樣品圖譜中10號峰為甘草苷、22號峰為甘草酸銨、23號峰為和厚樸酚和24號峰為厚樸酚。9號峰峰面積大小適中，基線分離，以9號峰為參照峰，其保留時間和峰面積為1，各共有峰的相對保留時間及相對峰面積分別列于表3、表4。10批厚樸四君子湯顆粒與對照指紋圖譜相似度分別為：0.981、0.973、0.980、0.962、0.973、0.984、0.986、0.975、0.901、0.991。各批厚樸四君子湯顆粒與對照指紋圖譜的相似度均較高，為了保證厚樸四君子湯顆粒的質(zhì)量，按中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004A版)計算，應(yīng)規(guī)定供試品指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度不得低于0.90。

圖1 10批厚樸四君子湯顆粒色譜匹配圖譜

圖2 厚樸四君子湯顆粒的HPLC圖譜

注：A對照指紋圖譜，B對照品色譜；10甘草苷、22甘草酸銨、23和厚樸酚、24厚樸酚

表3 10批厚樸四君子湯顆粒指紋圖譜共有峰的相對保留時間

續(xù)表3 10批厚樸四君子湯顆粒指紋圖譜共有峰的相對保留時間

表4 10批厚樸四君子湯顆粒指紋圖譜共有峰的相對峰面積

2.6.2 復(fù)方與藥材相關(guān)性研究 采用相同色譜條件測定各藥材及復(fù)方指紋圖譜，通過各色譜峰保留時間的比較分析，歸屬了 20個特征峰，其中5、6、7、8、9、18、19、23、24號峰來源于厚樸，10、11、12、14、15、16、21、22號峰來源于甘草，1、19號峰來源于厚樸和白術(shù)，2、4號峰來源于人參和茯苓，見圖4。3、13、17、20號峰不屬于任何單味藥，推斷其為厚樸四君子湯經(jīng)水煎煮過程中的化合產(chǎn)物。

3 討論

考察不同流動相體系、檢測波長和供試品溶液的制備方法，結(jié)果顯示以甲醇-0.1%磷酸為流動相體系梯度洗脫所得到的色譜圖基線較平穩(wěn)且分離效果好；檢測波長在240nm測定，特征峰數(shù)多且響應(yīng)靈敏度高；以50%甲醇超聲30min，所得色譜圖最大限度地反映了顆粒的特征。

圖4 厚樸四君子湯與其各單味藥HPLC指紋圖譜

注：A厚樸四君子湯顆粒；B厚樸藥材;C人參藥材;D白術(shù)藥材;E茯苓藥材；F甘草藥材

中藥復(fù)方制劑的多指標定量分析是目前質(zhì)量控制和評價的一個技術(shù)難點，其根本原因在于可供定量用的對照品有限[3]。中藥指紋圖譜是一種綜合性、可量化的鑒定手段，主要用于評價中藥材以及中藥制劑半成品質(zhì)量的真實性、優(yōu)良性和穩(wěn)定性，為中藥復(fù)方物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供方法學(xué)平臺。建立中藥指紋圖譜將能較為全面地反映中藥及其制劑中所含化學(xué)成分的種類與數(shù)量，進而對藥品質(zhì)量進行整體描述和評價，這也正好符合中醫(yī)理論的整體學(xué)說。[4]

本研究建立了厚樸四君子湯顆粒的HPLC指紋圖譜，此方法簡便、可靠、重現(xiàn)性好，為后續(xù)厚樸四君子湯顆粒藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究的深入開展奠定了基礎(chǔ)。以9號峰為參照峰確定了厚樸四君子湯顆粒的24個共有峰，并通過相似度計算軟件得到10批厚樸四君子湯顆粒的對照指紋圖譜及各批樣品與對照指紋圖譜之間的相似度，結(jié)果10批樣品相似度均在0.9以上。不同批號厚樸四君子湯顆粒指紋圖譜的色譜峰整體上基本一致，表明厚樸四君子湯顆粒提取工藝及制劑工藝都比較穩(wěn)定，對原料藥材的質(zhì)量控制良好，保證了厚樸四君子湯顆粒質(zhì)量的穩(wěn)定性和一致性，可以滿足生產(chǎn)的需要。本文所建立的HPLC指紋圖譜可有效控制厚樸四君子湯顆粒的質(zhì)量，同時研究結(jié)果顯示，厚樸四君子湯合煎后產(chǎn)生了各單味藥獨立水煎所不具有的新成分，提示復(fù)方水煎液所含藥物化學(xué)成分不等同于各單味藥藥物化學(xué)成分的簡單加合，從藥物化學(xué)的層面，再次驗證了“藥有個性之所長，方有合群之妙用”的古訓(xùn)[5]。

[1] 高永珍,武瑞珍,陳永利.四君子湯在中醫(yī)內(nèi)科疾病脾胃氣虛證中的應(yīng)用[J].中國民族民間醫(yī)藥,2013(05):52.

[2] 曾國慶,楊小秋,付英玉.厚樸四君子湯治療慢性胃炎療效觀察[J].中國實用醫(yī)藥,2012,7(34):128-129.

[3] 羅文,劉斌,王偉,等.基于降脂寧調(diào)脂抗氧化有效部位HPLC指紋圖譜的多指標成分定量方法研究[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2010,33(6):413.

[4] 孫響波,于妮娜,張法榮.黑地黃丸及其各單味藥HPLC指紋圖譜研究[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2014,1(16):64-65.

[5] 孫志翠,裴強偉,王欣，等.酸棗仁湯及其各單味藥HPLC 指紋圖譜研究[J].遼寧中醫(yī)雜志,2013,40(5):988-989.

(責(zé)任編輯：魏 曉)

HPLC Fingerprint of Houpo Sijun Decoction Granules and Correlativity with Its Relevant Herbs

Yang Xiaoqiu1,Luo Wenhui2,Dong Yujuan3,Peng Lishi3,Xu Cangxin3

(1. Nanshan District Xili People's Hospital of Shenzhen, Shenzhen 518055, China; 2.Guangdong Province Engineering Technology Research Institute of Chinese Medicine, Guangzhou 510095, China; 3.Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, China)

Objective:To establish the HPLC fingerprint of traditional Chinese medicines Houpo Sijun Decoction Granules and provide experimental basis for the quality control.Methods:The analytical column was SHISEIDO Capcell park MC C18(4.6mm×250mm，5μm).Gradient elution was used with mobile phase consisting of methanol-0.1% phosphoric. The detective wavelength was set at 240nm. The flow rate was 1.0 mL·min-1and the column temperature was maintained at 30℃. Establish the characteristic mode of HPLC fingerprint and the correlativity between fingerprint peaks of Houpo Sijun Decoction Granules and its component herbs was analyzed．Results:The HPLC fingerprint consisted of 24 common peaks，among which 20 peaks were assigned by parallel comparison with the fingerprints of Magnolia officinalis，Panax ginseng，Atractylodes macrocephala, Poria cocos,and Glycyrrhiza uralensis,and 4 peaks were identified by comparison with the chemical reference substances.Conclusion:The established HPLC fingerprint reflects the general character of Houpo Sijun Decoction Granules. It can be used as a quality control method for Houpo Sijun Decoction Granules.

Houpo Sijun Decoction Granules; Fingerprint; HPLC

2014-03-21

廣東省中醫(yī)藥局科研項目(20121044)

楊小秋(1963-), 男，廣東省深圳市南山區(qū)西麗人民醫(yī)院副主任中藥師,研究方向中藥學(xué)。

羅文匯(1980-)，男，廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院副主任中藥師,研究方向為中藥質(zhì)量評價。

R284.1

A

1673-2197(2014)13-0014-05