腦動(dòng)靜脈畸形患者外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量與SDF-1α變化☆

王凌雁 郭少雷 齊鐵偉 梁豐 黃正松

腦動(dòng)靜脈畸形患者外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量與SDF-1α變化☆

王凌雁*郭少雷**齊鐵偉**梁豐**黃正松**

目的 觀察腦動(dòng)靜脈畸形（arteriovenousmalformation,AVM）患者外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells,EPCs)數(shù)量和基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α(stromal cell-derived factor-l,SDF-1α)的變化。方法15例首次接受治療的腦AVM患者和15例健康對(duì)照者，應(yīng)用密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，以CD133+、CD34+、KDR+三陽(yáng)性細(xì)胞為EPCs，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)EPCs占外周血單個(gè)核細(xì)胞的百分比，ELISA法檢測(cè)外周血SDF-1α濃度，比較兩組差異；EPCs百分比、SDF-1α濃度與AVM大小，以及EPCs百分比與SDF-1α濃度分別進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果AVM患者外周血EPCs占外周血單個(gè)核細(xì)胞百分比及SDF-1α濃度高于健康對(duì)照者（t= 4.051,P＜0.05；t=3.606,P＜0.05)；EPCs百分比及SDF-1α與病灶大小不相關(guān)（r=0.092,P＞0.05；r=0.027，P＞0.05)，EPCs百分比與SDF-1α正相關(guān)（r=0.461，P＜0.05)。結(jié)論腦AVM患者存在外周血EPCs和SDF-1α水平升高的現(xiàn)象，可能與AVM患者骨髓EPCs動(dòng)員增加，參與AVM血管重塑和血管新生有關(guān)。

腦動(dòng)靜脈畸形內(nèi) 皮祖細(xì)胞SDF-1α

腦AVM是腦內(nèi)的異常血管結(jié)構(gòu)，由畸形動(dòng)脈、擴(kuò)張靜脈和發(fā)育異常的毛細(xì)血管床組成，是引起青年人顱內(nèi)出血的主要中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病[1]。目前有關(guān)AVM的發(fā)病機(jī)制并未闡明，越來(lái)越多的研究認(rèn)為AVM并非靜止性的病灶，而是經(jīng)歷著活躍的血管重塑和血管新生過(guò)程[2-3]。EPCs是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類來(lái)源于骨髓、具有分化和增殖能力的內(nèi)皮前體細(xì)胞，可以整合到血管新生部位并分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞，從而參與血管的修復(fù)和新生[4]。已有研究證實(shí)在腦和面部動(dòng)靜脈畸形病灶中存在內(nèi)皮祖細(xì)胞[5-6]，因此推測(cè)EPCs參與AVM的發(fā)生和發(fā)展。本研究對(duì)腦AVM患者外周血EPCs數(shù)量及SDF-1α濃度進(jìn)行檢測(cè)，以證實(shí)該疾病患者是否存在從骨髓動(dòng)員EPCs增加的情況。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并與患者或家屬簽署知情同意書(shū)。選擇首次發(fā)病，未經(jīng)栓塞、手術(shù)切除或放射治療的腦動(dòng)靜脈畸形患者15例，其中以出血為首發(fā)癥狀的患者需度過(guò)出血急性期且無(wú)顱內(nèi)壓增高表現(xiàn)，AVM診斷經(jīng)數(shù)字減影血管造影(DSA)或腦血管CT成像(CTA)檢查確診。15例患者中男9例，女6例，平均年齡（24.9±14.3）歲；動(dòng)靜脈畸形位于小腦者2例，其余13例位于幕上，畸形團(tuán)直徑在1 cm～5.5 cm，Sptzer-Martin分級(jí)1級(jí)4例、2級(jí)5例、3級(jí)5例、4級(jí)1例；首發(fā)癥狀為出血者8例、癲癇發(fā)作3例、頭痛2例，病灶對(duì)側(cè)下肢無(wú)力1例和無(wú)癥狀1例。按照年齡和性別相匹配的原則選擇同期在我院體檢中心進(jìn)行體檢的健康人作為對(duì)照，其中男9例、女6例，平均年齡（25.4±13.8）歲。所有入選患者和健康對(duì)照者需同時(shí)符合無(wú)有服用他汀類藥物史，無(wú)高血壓、糖尿病、高脂血癥和有感染存在。

1.2 方法

1.2.1 外周血的采集及單個(gè)核細(xì)胞分離 抽取患者安靜狀態(tài)下清晨空腹外周靜脈血約10mL置于肝素抗凝管中，標(biāo)本靜止后吸取上層血漿，10000 r/ min離心10min，取上清置于-80℃冰箱保存，用于檢測(cè)SDF-1α。剩余血標(biāo)本采用密度梯度離心法獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞，具體操作步驟為PBS等倍稀釋血液，將稀釋后的血沿試管壁緩慢加入15 mL人淋巴細(xì)胞分離液（天津?yàn)螅┮好嫔?，?000 r/min，室溫離心20min，離心后用吸管將上層與中層之間的單個(gè)核細(xì)胞層吸出到另一個(gè)管中，用PBS洗2遍，每次均以1500 r/min離心10 min，棄上清即得到高純度的單個(gè)核細(xì)胞。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)EPCs占外周血單個(gè)核細(xì)胞百分比 根據(jù)文獻(xiàn)提供方法[7]以0.5%BSA 100ul稀釋單個(gè)核細(xì)胞，加入10μL Fc受體阻斷劑((Miltenyi Biotec)室溫孵育10 min以阻斷抗體的非特異性結(jié)合，然后分別加入PE標(biāo)記的抗體CD133,FITC標(biāo)記的抗體CD34和APC標(biāo)記的抗體KDR(Miltenyi Biotec)各10μL至總體積140ul,4℃孵育30 min,0.5%BSA清洗2次去掉未結(jié)合抗體。0.5% BSA緩沖液重懸至200μL過(guò)濾到流式上樣管中，應(yīng)用Beckman-Coulter Epics Altra流式細(xì)胞儀檢測(cè)每份標(biāo)本中EPCs占外周血單個(gè)核細(xì)胞的百分比。

1.2.3 外周血SDF-1濃度測(cè)量 用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（R&D公司）檢測(cè)外周血SDF-1α含量。根據(jù)說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行檢測(cè)，每份血清標(biāo)本分成三份，取三次測(cè)量的平均值作為最終結(jié)果。

1.2.4 AVM測(cè)量 根據(jù)DSA檢查結(jié)果，在計(jì)算機(jī)上調(diào)整圖像三維視角測(cè)量畸形血管團(tuán)最大直徑作為判定AVM大小的指標(biāo)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 全部資料用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用spearman相關(guān)分析方法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血EPCs A：實(shí)框中圈定區(qū)為單個(gè)核細(xì)胞；B：R10區(qū)為CD133、CD34雙陽(yáng)性細(xì)胞；C：R7區(qū)為CD133、CD34、KDR三陽(yáng)性細(xì)胞

2.1AVM組外周血SDF-1α濃度與健康對(duì)照組比較 15例AVM患者和15例健康對(duì)照者外周靜脈血SDF-1α濃度分別為（1241.4±514.8）pg/mL和（332.2±272.4）pg/mL。兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，(t=3.606,P＜0.05)。

2.2AVM患者外周血EPCs占單個(gè)核細(xì)胞百分比與健康對(duì)照組比較 AVM組和健康對(duì)照組CD133+, CD34+,KDR+三陽(yáng)性細(xì)胞占外周血單個(gè)核細(xì)胞百分比分別為（0.024%±0.021%）和（0.006%±0.006%），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.051，P＜0.05)。(圖1，流式細(xì)胞儀檢測(cè)EPCs結(jié)果)。

2.3 相關(guān)性分析 AVM患者外周血SDF-1α的水平及外周血EPC百分比均與AVM病灶直徑無(wú)相關(guān)性(r=0.092,P=0.745和r=0.027,P=0.924)；外周血SDF-1α與外周血EPC百分比正相關(guān)(r=0.461,P＜0.05)。

3 討論

腦AVM是腦內(nèi)的異常血管結(jié)構(gòu)，是導(dǎo)致青年人顱內(nèi)出血的主要病因。越來(lái)越對(duì)的研究證實(shí)AVM并非靜止的先天性疾病，而是經(jīng)歷著不斷生長(zhǎng)、甚至再發(fā)的過(guò)程[2-3]。針對(duì)AVM手術(shù)切除標(biāo)本的病理研究發(fā)現(xiàn)AVM畸形血管團(tuán)周圍腦組織中毛細(xì)血管密度增加[8]，此外模擬AVM動(dòng)靜脈短路的缺血?jiǎng)游锬Ｐ鸵沧C實(shí)，造模后慢性低灌注腦組織中毛細(xì)血管密度增加[9]，上述研究均支持無(wú)論AVM病灶還是病灶周圍腦組織均存在血管新生的現(xiàn)象。

EPCs是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類由骨髓動(dòng)員的血管內(nèi)皮細(xì)胞前體細(xì)胞,具有高度增殖和定向分化等特點(diǎn)，EPCs不僅參與胚胎時(shí)期血管的形成,還參與出生后的血管新生和受損內(nèi)皮的修復(fù)過(guò)程。針對(duì)組織損傷修復(fù)以及多種腫瘤血管新生的研究均證實(shí)有EPCs的參與，有關(guān)心肌梗死和腦梗死的研究也發(fā)現(xiàn)EPCs與梗塞面積、梗死灶周圍血管密度及患者預(yù)后密切相關(guān)[7,10-12]。目前認(rèn)為EPCs作為血管內(nèi)皮細(xì)胞前體細(xì)胞，一方面可以通過(guò)自身轉(zhuǎn)化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，另一方面可以通過(guò)旁分泌的方式合成和分泌多種細(xì)胞因子影響內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和成管，進(jìn)而參與病理和生理狀態(tài)下內(nèi)皮細(xì)胞的更新以及血管新生。

本研究應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)AVM患者外周血EPCs的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD133+、CD34+、KDR+三陽(yáng)性EPCs占外周血單個(gè)核細(xì)胞百分比較正常健康人群明顯增高，說(shuō)明AVM患者從骨髓動(dòng)員EPCs增加，可能與EPCs參與AVM血管重塑和血管新生有關(guān)。Gao等[5-6]，對(duì)手術(shù)切除的AVM標(biāo)本進(jìn)行EPCs標(biāo)志物的檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)病灶中有EPCs存在，EPCs數(shù)量與AVM病理級(jí)別相關(guān)，支持上述觀點(diǎn)。

引起EPCs動(dòng)員和歸巢的因素包括一系列生長(zhǎng)因子以及炎癥因子，其中SDF-1/CXCR4軸起重要作用[13]。SDF-1屬于CXC細(xì)胞趨化因子亞家族，在體內(nèi)起主要作用的是SDF-1α，當(dāng)組織存在缺氧時(shí)可大量表達(dá)并釋放入血，SDF-1與EPCs表面CXCR4受體相作用，促使EPCs極化、沿SDF-1濃度梯度向病灶趨化[14]，并激活一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路，影響內(nèi)皮細(xì)胞分化、遷移、成管和一系列細(xì)胞因子表達(dá)[15-16]。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)AVM患者外周血中SDF-1α濃度較正常對(duì)照者增加，且與EPCs數(shù)量呈正相關(guān)，推測(cè)可能由于AVM病灶合成SDF-1增加，進(jìn)而動(dòng)員骨髓EPCs增加，并使其歸巢到AVM病灶參與AVM的血管重塑和血管新生。

引起AVM病灶SDF-1表達(dá)增加的原因，可能與低氧及病灶中VEGF表達(dá)增加有關(guān)。研究證實(shí)低氧誘導(dǎo)因子（HIF-1）是促進(jìn)SDF-1表達(dá)的強(qiáng)誘導(dǎo)因子[17]，而SDF-1和VEGF在促進(jìn)血管新生方面起協(xié)同作用，當(dāng)其中一種因子表達(dá)上調(diào)時(shí)，另一種因子的表達(dá)也會(huì)上調(diào)[14]。腦AVM是一種先天性發(fā)育異常的血管性疾病，由一團(tuán)雜亂、互相纏結(jié)的擴(kuò)張血管構(gòu)成，直接引流動(dòng)脈血到靜脈，導(dǎo)致高流速的血流經(jīng)過(guò)供血?jiǎng)用}、畸形血管團(tuán)到引流靜脈，因動(dòng)靜脈短路促使病灶及病灶周圍腦組織發(fā)生缺血是AVM的主要病理改變。已經(jīng)證實(shí)無(wú)論在AVM病灶還是病灶周圍腦組織中均存在HIF-1、VEGF高表達(dá)的現(xiàn)象[18-19]。此外AVM血流動(dòng)力學(xué)的改變可能也參與SDF-1合成和分泌增加，研究發(fā)現(xiàn)在AVM病灶中SDF-1主要表達(dá)于畸形血管的內(nèi)皮細(xì)胞[20]，而內(nèi)皮細(xì)胞是直接感受血流動(dòng)力學(xué)改變的最直接受體。

在我們的研究中未發(fā)現(xiàn)外周血中EPCs和SDF-1α水平與AVM大小存在相關(guān)性。提示病灶的體積并不是影響外周血EPCs和SDF-1α的決定因素，體積大的AVM雖然占有合成SDF-1細(xì)胞數(shù)量上的優(yōu)勢(shì)，但因血流動(dòng)力血改變不明顯，以及因盜血而導(dǎo)致的局部低氧情況并不嚴(yán)重，因此SDF-1α合成和分泌并未高于體積小的AVM，相反體積小的AVM由于存在高流量的供血?jiǎng)用}和深部引流靜脈可能引起局部缺血缺氧情況更加嚴(yán)重。有關(guān)此方面的研究還需擴(kuò)大病例數(shù)，進(jìn)行進(jìn)一步的分層分析。此外，栓塞和手術(shù)切除治療是否會(huì)影響AVM患者外周血EPCs數(shù)量及SDF-1水平也有待進(jìn)一步研究。

總之，我們的研究證實(shí)腦AVM患者存在外周血EPCs和SDF-1α水平升高的現(xiàn)象，推測(cè)AVM病灶局部合成和分泌SDF-1α增加，導(dǎo)致EPCs從骨髓動(dòng)員和歸巢到AVM病灶可能參與AVM的發(fā)生和發(fā)展。

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Circulating endothelial progenitor cells and SDF-1αare increased in cerebral arteriovenous malformation patients.

WANG Lingyan,GUO Shaolei,QITiewei,LIANG Feng,HUANG Zhengsong.
Department of Neurosurgery,The First Affiliated HospitalofSun Yat-Sen University,Guangzhou 510080,China.Tel:020-87755766-8223.

ObjectiveThe purpose of this study was to investigate if circulating endothelial progenitor cells(EPCs) and stromal cell-derived factor-1α(SDF-1α)are increased in patients of cerebral arteriovenousmalformation(AVM).MethodsFifteen AVM patients not receiving any treatmentand 15 healthy people were included in this study.Peripheral bloodmononuclear cellswere isolated by density gradient centrifugation and EPCswas characterized by triple staining using antibodies against CD133,CD34,and vascular endothelial growth factor receptor-2(KDR).The percentage of circulating endothelial progenitor cellswere analysised by flow cytometry.Serum concentrations of SDF-1αwas determined by using enzyme-linked immunosorbentassay（ELISA).ResultsThe percentage of circulating EPCs and concentrations of SDF-1αwere significantly higher in AVM group than in control group（t=4.051，P＜0.05 and t=3.606，P＜0.05,respectively).Therewas a positive correlation between the percentage of circulating EPCs and concentrations of SDF-1α in AVM patients(r=0.461,P＜0.05).However,there were no correlation either between the percentage of circulating EPCs and the size of AVM or between concentrations of SDF-1αand the size of AVM in AVM patients（r=0.092,P＞0.05 and r=0.027,P＞0.05 respectively).ConclusionsThe percentage of circulating EPCs and concentrations of SDF-1α are increased in AVM patients and the increase in themobilization of EPCs from bonemarrow may play a role in blood vessel remodelingand neovasculization in AVM patients.

Cerebral arteriovenous malformation Endothelial progenitor Cells SDF-1α

R743.4

A

2014-01-14）

（責(zé)任編輯:李立）

10.3936/j.issn.1002-0152.2014.05.005

☆國(guó)家自然基金面上項(xiàng)目（編號(hào)：81171102）

*中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科ICU(廣州510080）

**中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科