不同水平高血糖對大鼠局灶腦缺血損傷的影響☆

石見 譚盛 吳培華 陳健

不同水平高血糖對大鼠局灶腦缺血損傷的影響☆

石見*譚盛*吳培華*陳健*

目的 觀察不同水平高血糖對大鼠局灶腦缺血的影響。方法將23只成年雄性大鼠隨機分為正常血糖組（N）6只、高血糖1組（H1）6只、高血糖2組（H2）11只。采用線栓法建立90min局灶腦缺血模型（middle cerebralartery occlusion,MCAO），缺血開始后5m in、50min、95min三個時間點，通過腹腔注射不同劑量50%葡萄糖溶液使其血糖分別維持在10mmol/L（H 1）和20mmol/L（H2）。正常血糖組（N）在相同時間點注射生理鹽水作為對照。腦缺血后24 h采用mNSS評分和rotarod評估神經(jīng)損傷嚴重程度，TTC染色檢測腦梗死面積。結果與N組相比，H2組mNSS和rotarod評分更差，腦梗死面積增加24.26%（P＜0.01）。H1組與N組比較，mNSS、rotarod評分以及腦梗死面積無顯著差異（P＞0.05）。結論卒中后嚴重高血糖（20mmo/L）顯著增大腦梗死面積，加重神經(jīng)功能損傷，而輕度高血糖（10mmol/L）對腦梗死面積和神經(jīng)功能損傷無顯著影響。

腦缺血 高血糖 mNSS評分 rotarod TTC

流行病學及臨床研究表明，約40%～70%急性缺血性腦卒中患者存在卒中后高血糖[包括潛在的糖耐量減低（underlying impaired glucose tolerance）、未診斷的糖尿?。╱nrecognized diabetesmellitus）和應激性高血糖（stresshyperglycemia）][1-2]，且這部分患者較正常血糖者不良事件發(fā)生率、死亡率增加[3-4]。然而嚴格降糖治療是否能改善急性缺血性腦卒中患者的預后仍缺乏循證醫(yī)學證據(jù)[5]。正確理解卒中后高血糖病生機制對更大規(guī)模臨床試驗設計非常重要。但是在基礎研究領域，動物局灶腦缺血后高血糖的研究結果不盡一致，部分研究表明高血糖增加腦梗死面積，另一部分研究提示輕度高血糖可能有益[6-7]。本實驗通過線栓法建立大鼠大腦中動脈缺血模型，腹腔注射不同劑量50%葡萄糖溶液，維持卒中后血糖為輕度高血糖（10 mmol/L）、嚴重高血糖（20mmol/L），與血糖正常對照組（5～6mmol/L）對比觀察24 h后腦梗死面積和神經(jīng)功能缺損情況，為臨床卒中急性期血糖管理提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠18只，SPF級，由南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供,合格證號:SCXK（粵）2011-0015,體重240～260 g。飼養(yǎng)溫度24℃，相對濕度40%～70%，明暗周期12 h，正常飲食，自由飲水。所有實驗動物的飼養(yǎng)及操作均符合廣東省及南方醫(yī)科大學動物管理條例，遵循“3R”原則。隨機分組：正常血糖組（5mmol/L，N）6只，高血糖1組（10 mmol/L，H1）6只，高血糖2組（20mmol/L，H2）11只（因前期預實驗發(fā)現(xiàn)H2組造模后約死亡一半，故實驗分組時，增加H2組實驗動物數(shù)量）。

1.2 建立大鼠局灶腦缺血（MCAO）模型 采用改良Zea-Longer插線栓方法制作大鼠右側(cè)大腦中動脈閉塞模型(MCAO)。具體方法：大鼠術前禁食15～17 h，不禁水，腹腔注射3%戊巴比妥鈉（0.2 mL/kg）麻醉后，取大鼠頸部正中縱向切口，切開皮膚，游離右側(cè)頸外動脈、頸總動脈及頸內(nèi)動脈。離斷頸外動脈2個小分支血管，在距離頸總動脈分叉5mm遠心端用4-0絲線結扎離斷頸外動脈，在頸外動脈靠近頸總動脈分叉處打一個活結備用。用血管夾暫時夾閉右側(cè)頸總動脈及頸內(nèi)動脈起始端。在頸外動脈距離分叉4mm處剪一破口，線栓（直徑0.26mm的魚線蘸蠟后灼燒頭端使之膨大，用肝素浸泡）由破口插入頸外動脈，結扎緊預留的線結，松開血管夾，沿頸內(nèi)動脈方向插入線栓，待線栓進入21～22 mm稍有阻力感，停止插線栓。線栓放置90 min后撤出線栓，結扎緊預留線結?？p皮、消毒。術中加熱墊保溫，待麻醉蘇醒后自由進食飲水，單籠喂養(yǎng)。

1.3 誘導卒中后高血糖（poststroke hyperglycemia）H1組和H2組在缺血后5 min開始接受間隔45min共3次腹腔注射（intraperitoneal injection，IP）50%葡萄糖溶液（如圖1A所示）。H1組和H2組首次注射50%葡萄糖溶液劑量分別為2.5 mL/ kg、8mL/kg，隨后2次均按2mL/kg進行腹腔注射，維持缺血后10mmol/L及20mmol/L血糖水平；正常血糖組按2mL/kg共3次注射生理鹽水。缺血開始時、每次腹腔注射后30min取尾尖血測定血糖水平。腦缺血后12 h內(nèi)，H2組有5只死亡。

1.4 神經(jīng)功能缺損程度評分 采用改良神經(jīng)功能缺損程度評分方法(modified Neurological Severity Score,mNSS)在術后24 h分別對其進行評分，包括運動、感覺、反射等方面。得分越高提示神經(jīng)功能損傷越重：總分14分，10～14分重度受損；5～9分中度受損；1～4分輕度受損。

1.5 轉(zhuǎn)桿實驗（Rotarod）本實驗采用自動旋轉(zhuǎn)桿監(jiān)測儀（Harvard Apparatus，圖3A）來評價大鼠運動協(xié)調(diào)能力。MCAO前3 d為訓練實驗，將大鼠置于轉(zhuǎn)桿上，轉(zhuǎn)速在5min內(nèi)從4 rpm升至40 rpm，每天訓練5次，每次間隔15min。大鼠在轉(zhuǎn)桿上爬行開始計時，大鼠從轉(zhuǎn)桿跌落至腳踏板上，自動停止計時，記錄下大鼠在轉(zhuǎn)桿上停留的時間（latency）。在MCAO前1 d，每只動物進行3次轉(zhuǎn)桿測試實驗，取3次試驗平均值作為基線值。MCAO后24 h，進行3次轉(zhuǎn)桿實驗，rotarod運動測試數(shù)據(jù)表示為3次實驗平均值與自身對照基線值的百分比。

1.6TTC染色 MCAO后24 h處死大鼠，斷頭取腦，放入0.1mmol/L PBS的冰水混合物中1min后取出。置入大鼠腦槽中，自額極起間隔2mm連續(xù)冠狀切片，共切腦片6片。將腦片迅速浸泡于2% TTC溶液（Sigma公司，美國）中，常溫孵育6min，翻轉(zhuǎn)腦片繼續(xù)孵育6min，顯色（正常腦組織呈紅色，梗死部分呈現(xiàn)白色）后4%多聚甲醛固定6 h，拍照記錄，使用圖像分析軟件IPP（Image Pro Plus）進行腦梗死面積分析。為矯正缺血后腦水腫，結果記錄為腦梗死面積百分比（%）=腦梗死面積/缺血對側(cè)腦面積。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS18.0進行統(tǒng)計學分析，所有實驗數(shù)據(jù)均以（x±s）表示。行為學數(shù)據(jù)（rotarod實驗，和mNSS）使用Shapiro-Wilk進行正態(tài)性分布檢驗。組間比較使用單因素方差分析，采用Tukey檢驗進行組間均值兩兩比較。檢驗水準α=0.05。

2 結果

MCAO后間隔45min，共3次腹腔注射50%葡萄糖溶液，使高血糖1組（H1）和高血糖2組（H2）卒中后血糖水平分別維持在10 mmol/L及20 mmol/L左右，正常血糖組（N）腹腔注射生理鹽水，卒中后血糖水平在5～6mmol/L（圖1B）。

2.1 神經(jīng)功能缺損程度評分（mNSS）結果 正常血糖組（N）、高血糖1組（H1）和高血糖2組（H2）改良的神經(jīng)功能缺損程度評分（x±s）分別為4.00± 0.89、5.17±1.17和8.83±1.17。高血糖2組（H2）神經(jīng)功能中度受損，與正常血糖組（N）和高血糖1組（H1）相比，差異有統(tǒng)計學意義（F=32.406，P＜0.01）。高血糖1組（H1）與正常血糖組神經(jīng)功能輕中度受損，兩者對比無統(tǒng)計學差異（P=0.184），見圖2。

2.2 轉(zhuǎn)桿實驗結果 各組rotarod實驗結果分別為：57.42%±5.35%（正常血糖組）、51.06%±6.71%（高血糖1組）、31.42%±5.65%（高血糖2組）。高血糖2組（H2）腦缺血后運動功能缺損程度更嚴重（F=31.31，P＜0.01），高血糖1組（H1）與正常血糖組相比無統(tǒng)計學意義（P=0.185），見圖3B。

2.3TTC染色結果 實驗結果顯示，正常血糖組（N）、高血糖1組（H1）和高血糖2組（H2）腦梗死面積百分比分別為24.93%±5.31%、，30.87%± 3.68%和49.19%±2.02%。統(tǒng)計結果證實，高血糖2組（20 mmol/L）腦梗死面積顯著增大（F=52.40，P＜0.01），而高血糖1組（10mmol/L）與正常血糖組比較無統(tǒng)計學意義（P=0.079），見圖4。

3 討論

大量臨床觀察性研究表明急性缺血性腦卒中伴血糖升高者，死亡率升高、卒中后90 d神經(jīng)功能恢復差[2]。既往研究認為高血糖可能通過多種途徑增大腦梗死面積，從而使患者預后變差[8-10]。但一項針對卒中后高血糖采取嚴格降糖治療的隨機對照試驗表明，葡萄糖-鉀-胰島素（glucose potassium insulin，GKI）靜脈輸注降低血糖水平，但未能減少腦梗死面積[11]。該隨機對照試驗未能得出顯著性結果，可能由于未達到預先設計的樣本量，導致檢驗效能下降，但也可能由于納入的非干預組平均血糖水平僅輕度升高（約7mmol/L）。流行病學研究指出臨床卒中后高血糖水平主要集中在7～12mmol/L[1]，提示輕度升高的血糖可能并不會加重缺血缺氧損傷及增大腦梗死面積。本研究輕度高血糖組（10mmol/L，H1）血糖水平很好的符合臨床卒中后高血糖的波動范圍，與正常血糖組（5～6mmol/L，N）相比，結果顯示兩組間腦梗死面積差異無統(tǒng)計學意義，同時神經(jīng)功能缺損評分（mNSS）和運動協(xié)調(diào)性（rotarod）也無顯著性差異。雖然既往文獻報道認為MCAO模型中高血糖顯著增大腦梗死面積，但多利用鏈脲霉素（streptozotocin，STZ）破壞胰腺β細胞，產(chǎn)生1型糖尿病，誘導形成高血糖。1型糖尿病患者存在下丘腦-垂體-腎上腺軸（hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA）過度激活伴循環(huán)血液中腎上腺皮質(zhì)激素（adrenal glucocorticoids）水平顯著升高，本身HPA軸的過度激活就會增大腦梗死面積，Martin等[12]也證實使用腎上腺皮質(zhì)激素抑制劑美替拉酮（metyrapone）可減少皮層梗死面積。我們認為本研究的結果更具有說服力，因為我們選取的腹腔注射葡萄糖溶液誘導高血糖的方式不涉及復雜的病生機制，能更清楚的闡明高血糖與腦梗死面積的關系。我們綜述文獻后發(fā)現(xiàn)采用直接注射葡萄糖方式誘導高血糖的相關基礎研究選取的血糖水平超過20mmol/L，并較一致認為該水平高血糖使腦梗死面積顯著增大[6]。本實驗同樣發(fā)現(xiàn)嚴重高血糖（20mmol/L）與血糖正常對照組（5～6mmol/L）對比，腦梗死面積增加24.26%，同時局灶腦缺血后神經(jīng)功能缺損程度加重（mNSS評分和rotarod實驗結果）。因此，葡萄糖作為腦組織的最重要的功能物質(zhì)，其水平輕度升高并不會影響神經(jīng)功能，造成腦梗死面積增大，但當其超過一定限度，則加重缺血后腦損傷。然而本研究存在一定的局限性。眾所周知，缺血性腦卒中急性期高血糖可能存在兩種主要情形：①患者既往合并糖尿病或糖耐量異常，缺血性腦損傷致使原有的代謝紊亂惡化；②既往無糖代謝異常，缺血性腦損傷引起應激性血糖升高[13]。針對這兩種不同情況，一項納入375例缺血性腦卒中患者的臨床研究僅在非糖尿病者中觀察到高血糖與腦梗死面積增大以及神經(jīng)功能惡化的關系[14]?？梢姡捎谔悄虿∩婕暗牟∩鷻C制更為復雜，卒中后高血糖對糖尿病患者的影響不同于非糖尿病者。而本研究采用腦缺血后腹腔注射葡萄糖動物模型，更符合卒中后應激性高血糖的臨床特征，并不能模擬既往存在糖尿病或糖耐量異常的情況。

圖1 實驗設計圖A.腦缺血開始后各個腹腔注射和血糖測定時間點B.三組動物血糖測定結果

圖2 改良神經(jīng)功能缺損程度評分（*與正常血糖組對比P＜0.01）

圖3 轉(zhuǎn)桿實驗A.自動旋轉(zhuǎn)桿監(jiān)測儀B.不同水平高血糖對轉(zhuǎn)桿實驗結果影響（*與正常血糖組對比P＜0.01）

圖4 不同水平高血糖對腦梗死面積影響A.TTC染色結果B.腦梗死面積定量統(tǒng)計分析結果（*與正常血糖組對比P＜0.01）

綜上所述，一定程度卒中后高血糖（10mmo/L左右）不會顯著增大腦梗死面積，加重缺血性腦損傷，而嚴重高血糖（20mmol/L）顯著增大腦梗死面積并加重神經(jīng)功能缺損程度。本研究為進一步臨床干預性實驗制定卒中后高血糖降糖治療目標值提供一定參考。

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2013-12-22）

（責任編輯:李立）

10.3936/j.issn.1002-0152.2014.05.012

☆國家自然科學基金（編號：81301098）；廣州市海珠區(qū)科技計劃項目（編號：2011-YL-06）

*南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（廣州510282）