黃芩苷對(duì)海人酸致癇小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響

歐陽(yáng)龍強(qiáng) 楊少春 鄒連生 梁日生 劉德華 高志強(qiáng) 程偉

黃芩苷對(duì)海人酸致癇小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響

歐陽(yáng)龍強(qiáng)*楊少春*鄒連生*梁日生△劉德華*高志強(qiáng)*程偉*

目的 探討黃芩苷對(duì)海人酸誘導(dǎo)的小鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)后海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響。方法54只ICR雄性小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE)組、黃芩苷治療組（100mg/kg）。采用腹腔內(nèi)注入海人酸（12mg/kg）建立小鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)模型。通過(guò)TUNEL染色觀察小鼠海馬CA1、CA3區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡程度；免疫組化觀察海馬組織中caspase-3細(xì)胞的陽(yáng)性表達(dá)情況；RT-PCR檢測(cè)海馬組織中Bax、Bcl-2mRNA的含量；Western blot檢測(cè)Bax、Bcl-2和caspase-3蛋白的表達(dá)量。結(jié)果與癲癇持續(xù)狀態(tài)組相比，黃芩苷可顯著減輕癲癇持續(xù)狀態(tài)后海馬神經(jīng)細(xì)胞的凋亡(CA1區(qū):0.3984±0.0586 vs.0.7258±0.0235,P＜0.05;CA3區(qū):0.3593±0.0391 vs. 0.6191±0.0686,P＜0.05)，降低海馬中BaxmRNA的合成和Bax、caspase-3蛋白的表達(dá)(P＜0.05)，增加Bcl-2mRNA及蛋白的表達(dá)(P＜0.05)。結(jié)論黃芩苷能夠減輕小鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)后海馬神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，其作用機(jī)制可能通過(guò)上調(diào)Bcl-2的表達(dá)和下調(diào)Bax、caspase-3的表達(dá)來(lái)發(fā)揮抗凋亡作用。

癲癇 黃芩苷 海人酸 凋亡

癲癇(epilepsy，EP)是一組由大腦神經(jīng)元異常放電引起短暫性中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常為特征的慢性腦部疾病。海馬是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)對(duì)癲癇最敏感的腦區(qū)之一，癲癇發(fā)作可引起海馬特定區(qū)域（CA1區(qū)、CA3區(qū)、齒狀回、梨狀皮質(zhì)區(qū)等，尤以CA1區(qū)、CA3區(qū)最甚）神經(jīng)細(xì)胞凋亡或壞死[1]。有研究[2]顯示，癲癇發(fā)作所引起的腦損傷主要由神經(jīng)元凋亡主導(dǎo)，有效控制神經(jīng)元的凋亡能減少癲癇發(fā)作所引起的神經(jīng)元損傷。黃芩苷（Baicalin）是中藥黃芩中提取的單體化合物，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡、抗腫瘤等功能[3]，我們前期研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷對(duì)小鼠癲癇后海馬神經(jīng)細(xì)胞具有抗凋亡作用[4]，但其具體機(jī)制尚不清楚。本研究采用海人酸（kainic acid,KA)建立癲癇模型，進(jìn)一步探討黃芩苷對(duì)小鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)后海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響及其作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的ICR健康雄性小鼠54只[許可證號(hào)：SCXK(滬) 2007-0005]，體質(zhì)量23～28g。隨機(jī)分對(duì)照組、癲癇持續(xù)狀態(tài)（SE）組和黃芩苷治療組，每組18只。主要藥品、試劑與儀器：黃芩苷購(gòu)自美國(guó)sigma公司;海人酸購(gòu)自美國(guó)BIOMOL公司;RT-PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；兔抗鼠Bax、Bcl-2多克隆抗體購(gòu)自santa Cruz公司；兔抗鼠caspase-3多克隆抗體購(gòu)自santa Cruz公司；兔超敏二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 制模與給藥 采用腹腔內(nèi)注入KA（12mg/kg）建立小鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)模型。按Racines[5]分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)癲癇行為：0級(jí)，正常行為；I級(jí)，面部肌肉痙攣表現(xiàn)為咀嚼運(yùn)動(dòng)、眨眼、動(dòng)須等，濕狗樣顫動(dòng)；Ⅱ級(jí)，頸部肌肉痙攣表現(xiàn)為點(diǎn)頭運(yùn)動(dòng)；Ⅲ級(jí)，一側(cè)前肢陣攣；Ⅳ級(jí)，站立伴雙前肢陣攣；V級(jí)，在Ⅳ級(jí)的基礎(chǔ)上身體向后倒下失去平衡，四肢抽動(dòng)。達(dá)到Ⅲ級(jí)改變以上者定為癲癇發(fā)作，連續(xù)的癇性發(fā)作超過(guò)30 min以上者為SE。制模過(guò)程中因癲癇持續(xù)狀態(tài)死亡3只，制模成功率約75%，制模不成功者予以剔除，不足預(yù)定數(shù)額者按照隨機(jī)抽樣原則補(bǔ)齊動(dòng)物并重新制備模型。制模成功后，黃芩苷治療組以100mg/kg的劑量腹腔注射黃芩苷1次，12h后重復(fù)注射1次（黃芩苷生物半衰期較短，本實(shí)驗(yàn)采取2次給藥法，結(jié)合既往的研究結(jié)果，黃芩苷100mg/kg為最適藥物濃度[6]）。SE組和對(duì)照組注入等量的生理鹽水。ICR小鼠每組6只，10%水合氯醛腹腔麻醉后，用生理鹽水與4%多聚甲醛心臟灌注取腦，4%多聚甲醛浸泡過(guò)夜，前囟后1.8～3.0mm處腦冠狀切面行石蠟切片，用于TUNEL染色和免疫組化；每組另取12只ICR小鼠，麻醉后斷頭取雙側(cè)海馬，提取總蛋白與RNA，分別用于Western blot與RT-PCR。

1.3 TUNEL法檢測(cè)神經(jīng)元凋亡 按TUNEL試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色與檢測(cè)。光鏡下觀察海馬CA1、CA3區(qū)棕褐色TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，并計(jì)數(shù)連續(xù)3張切片整個(gè)CA1、CA3區(qū)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，在400倍視野計(jì)算平均陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。

1.4 免疫組化檢測(cè)caspase-3的分布 石蠟切片常規(guī)脫蠟脫水。按照說(shuō)明書(shū)采用SP法進(jìn)行染色。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。caspase-3一抗?jié)舛葹?：100。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸分化，氨水返藍(lán)。光學(xué)顯微鏡觀察、拍片。

1.5RT-PCR檢測(cè)Bcl-2和BaxmRNABcl-2引物序列(240bp)：5'-CTC GTC GCT ACC GTC GTG ACT TCG-3'(上游)，5'-CAG ATG CCC GTT CAG GTA CTCAGTC-3'(下游)。Bax引物序列(360bp)：5′-AAG CTG AGCGAG TGTCTCCGGCG′(上游)，5′-GCC ACA AAG ATG GTC ACT GTC TGCC-3′(下游)。內(nèi)參β-actin引物序列(198bp)：5′ATC GTG CGT GAC ATC AAA GAGA3′(上游)，5′TGC CAC AGG ATTCCA TACCCAA3′(下游)。用Trizol提取海馬組織總RNA。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，操作步驟根據(jù)RT-PCR試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。PCR反應(yīng)條件設(shè)置如下：94℃預(yù)變性4min，94℃變性40 s，退火(Bcl-2:58℃40 s;Bax:60℃40s),72℃延伸1min，32個(gè)循環(huán)。PCR結(jié)果采用凝膠掃描分析儀掃描凝膠，并分析Bcl-2、Bax與β-actin基因譜帶的積分光密度，以兩者比值(即相對(duì)系數(shù))表示Bcl-2、BaxmRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.6Western blot檢測(cè)Bcl-2和Bax蛋白取各組小鼠雙側(cè)海馬組織，勻漿后分別提取總蛋白以牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線，BCA法測(cè)定蛋白濃度。常規(guī)電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉后分別加入Bcl-2、Bax一抗抗體（1:800用TBST稀釋）,4°C靜置過(guò)夜，洗膜，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗（1:2500用TBST稀釋），TBST洗膜3次，吸取等量SuperSignal-WestPico超靈敏型檢測(cè)試劑盒A液、B液，均勻滴于NC膜上進(jìn)行化學(xué)發(fā)光膠片顯影，圖像由Bio-Rad公司Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng)掃描，圖像分析用Quantity One（version 4.6）分析軟件完成，計(jì)算Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS 17.0,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以(±s)表示，采用單因素方差分析進(jìn)行組間差異的顯著性檢驗(yàn)，再用Bonferroni法進(jìn)行兩兩比較，檢測(cè)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)觀察 KA注射后0.2～3h，小鼠逐漸出現(xiàn)凝視、翹尾、轉(zhuǎn)圈、陣發(fā)性頭面部肌肉抽搐、節(jié)律性點(diǎn)頭，前肢陣攣、后肢站立、全面強(qiáng)直-陣攣發(fā)作，直至出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)。4h后發(fā)作逐漸減少，至6～24 h，SE組小鼠仍可出現(xiàn)或Ⅳ級(jí)癲癇發(fā)作，而黃芩苷治療組小鼠隨治療次數(shù)增加，癲癇發(fā)作級(jí)別多為Ⅲ級(jí)以下，且發(fā)作次數(shù)有所減少。對(duì)照組小鼠未觀察到癲癇發(fā)作。

2.2 黃芩苷對(duì)癲癇鼠海馬TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞的影響 TUNEL染色結(jié)果顯示，對(duì)照組基本未見(jiàn)棕褐色的陽(yáng)性顆粒細(xì)胞，而癲癇持續(xù)狀態(tài)后海馬CA1、CA3區(qū)棕褐色陽(yáng)性細(xì)胞顯著增加，黃芩苷治療組海馬CA1、CA3區(qū)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞較SE組明顯減少，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(CA1區(qū)：F=255.8，P= 0.016；CA3區(qū)：F=135.6，P=0.008),見(jiàn)圖1、表1。

2.3 免疫組化觀察小鼠海馬中caspase-3的活化及分布情況 對(duì)照組可見(jiàn)海馬CA1、CA3區(qū)有少量散在caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞，著色不深。SE組海馬CA1、CA3區(qū)可見(jiàn)數(shù)目較多的陽(yáng)性細(xì)胞，且分布密集。表現(xiàn)為胞漿及核膜著色，呈棕黃色，著色較深，胞漿內(nèi)可見(jiàn)棕黃色顆粒沉淀物。與SE組相比，黃芩苷治療組海馬CA1、CA3區(qū)的棕黃色顆粒狀陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少，著色較前者淺，二者差異明顯（見(jiàn)圖2）。

表1 海馬CA1、CA3區(qū)TUNEL染色細(xì)胞凋亡率(±s)

表1 海馬CA1、CA3區(qū)TUNEL染色細(xì)胞凋亡率(±s)

1）經(jīng)Bonferroni檢驗(yàn)，與對(duì)照組比較，P＜0.01；2)經(jīng)Bonferroni檢驗(yàn)，與SE組比較，P＜0.05

組別SE組黃芩苷治療組對(duì)照組n 6 6 6 CA1區(qū)細(xì)胞凋亡率0.7258±0.02351)0.3984±0.05861)2)0.0128±0.0222 CA3區(qū)細(xì)胞凋亡率0.6191±0.06861)0.3593±0.03911)2)0.0063±0.0066

圖1 TUNEL染色檢測(cè)小鼠海馬CA1、CA3區(qū)的細(xì)胞凋亡（400×，圖中棕褐色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)）(A-C為CA 1區(qū)；D-F為CA3區(qū)。A、D為SE組；B、E為黃芩苷治療組；C、F為對(duì)照組；)

圖2 免疫組化觀察小鼠海馬CA1、CA3區(qū)caspase-3的活化及分布情況（200×）。A-C為CA1區(qū)；D-F為CA3區(qū)。A、D為SE組；B、E為黃芩苷治療組；C、F為對(duì)照組

2.4 黃芩苷對(duì)癲癇小鼠海馬Bcl-2和BaxmRNA表達(dá)的影響 自小鼠海馬組織提取的總RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增后，均出現(xiàn)了背景清晰但亮度不同的條帶，表示各組均有Bcl-2和BaxmRNA的表達(dá)(圖3)，對(duì)各組條帶進(jìn)行光密度分析，可見(jiàn)對(duì)照組僅有少量的Bcl-2和BaxmRNA表達(dá)。與對(duì)照組相比，SE組Bcl-2 mRNA無(wú)明顯差異（F=17.3，P=0.527），而B(niǎo)axmRNA表達(dá)則明顯增多(F=53.8，P=0.006)。與SE組相比，黃芩苷治療組則明顯增加Bcl-2 mRNA的表達(dá)（F=17.3，P=0.018），降低BaxmRNA的表達(dá)(F=53.8，P=0.022)，見(jiàn)表2。

2.5 黃芩苷對(duì)癲癇小鼠海馬內(nèi)Bcl-2、Bax及caspase-3蛋白表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示，對(duì)照組Bcl-2、Bax及caspase-3蛋白的表達(dá)量均較少。與對(duì)照組相比，SE組Bcl-2蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異（F=105.8，P=0.065），而B(niǎo)ax和caspase-3蛋白的表達(dá)則明顯增多(Bax：F=13.2，P=0.008；caspase-3:F=59.2，P=0.002)。與SE組相比，黃芩苷治療組則明顯增加Bcl-2蛋白的表達(dá)（F=105.8，P= 0.005），降低Bax和caspase-3蛋白的表達(dá)(Bax：F= 13.2，P=0.027；caspase-3:F=59.2，P=0.004)(圖4、表3)。

3 討論

圖3 各組mRNA表達(dá)情況,1：SE組；2：黃芩苷治療組；3：對(duì)照組

圖4 小鼠海馬組織中Bcl-2、Bax及caspase-3蛋白的表達(dá)水平。1：SE組；2：黃芩苷治療組；3：對(duì)照組

癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus，SE)是神經(jīng)科常見(jiàn)的急癥之一，也是最嚴(yán)重的癲癇發(fā)作形式，具有很高的發(fā)病率和致殘率，給患者的生活和工作造成極大影響[7]。即往認(rèn)為，壞死是癲癇后神經(jīng)細(xì)胞死亡的唯一方式，但近幾年研究發(fā)現(xiàn)，癲癇發(fā)作后神經(jīng)元死亡存在另一種死亡形式，即凋亡[8]。較多的研究顯示顳葉癲癇中海馬神經(jīng)細(xì)胞丟失以細(xì)胞凋亡為主，癲癇發(fā)作后腦神經(jīng)元有大量凋亡現(xiàn)象出現(xiàn)，因此凋亡被普遍認(rèn)為是癲癇后腦神經(jīng)元死亡的一種形式[3，8]。細(xì)胞凋亡是由多種基因控制的，有促進(jìn)凋亡的基因如Bax；也有抗凋亡的基因如Bcl-2。Bax是一種重要的促進(jìn)細(xì)胞凋亡基因，它可以使細(xì)胞色素C得以穿過(guò)線粒體膜，使caspase-9激活，并進(jìn)一步激活caspase-3，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Tuunanen等[9]發(fā)現(xiàn)癲癇發(fā)作后海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)早期即可檢測(cè)出明顯增多的Bax凋亡蛋白。Bcl-2是凋亡的中心調(diào)節(jié)蛋白之一，參與許多疾病的發(fā)生，對(duì)凋亡具有負(fù)調(diào)控作用，其抑制細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制可能有以下幾種：①Bcl-2通過(guò)改變細(xì)胞器的Ca2+外流抑制細(xì)胞凋亡；②通過(guò)抗氧化作用和抑制自由基來(lái)抑制細(xì)胞凋亡；③Bcl-2還可以和Bax等促凋亡基因結(jié)合形成Bcl-2／Bax異二聚體來(lái)抑制細(xì)胞凋亡；④Bcl-2阻斷P53進(jìn)入核內(nèi)，從而阻斷P53誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[10]。Jurgensmei等[11]發(fā)現(xiàn)，Bcl-2可抑制線粒體膜電位的降低、細(xì)胞色素和凋亡誘導(dǎo)因子的釋放及caspase的激活從而抑制凋亡。本研究通過(guò)TUNEL染色觀察小鼠海馬CA1、CA3區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡程度；以及檢測(cè)檢測(cè)Bax、Bcl-2和caspase-3的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，小鼠癲癇發(fā)作后細(xì)胞凋亡數(shù)目增多，Bax、caspase-3的表達(dá)也明顯增多，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

表2 RT-PCR檢測(cè)Bcl-2和Baxm RNA在不同組別的相對(duì)表達(dá)量±s)

表2 RT-PCR檢測(cè)Bcl-2和Baxm RNA在不同組別的相對(duì)表達(dá)量±s)

1）經(jīng)Bonferroni檢驗(yàn)，與對(duì)照組比較，P＜0.05；2)經(jīng)Bonferroni檢驗(yàn)，與SE組比較，P＜0.05

組別SE組黃芩苷治療組對(duì)照組n 6 6 6 Bcl-2/β-actin mRNA 1.1935±0.3503 2.0915±0.24561）2）0.8610±0.1677 Bax/β-actinmRNA 2.2397±0.20811）1.6775±0.11571）2）0.7803±0.1845

黃芩苷是中藥黃芩中提取的單體化合物，屬葡萄糖醛酸苷類，易通過(guò)血-腦屏障，目前臨床主要用于抗菌、消炎、抗感染治療。有研究顯示，黃芩苷還具有抗氧化、抗凋亡等功能[3]，并已廣泛運(yùn)用于脊髓缺血損傷、腦缺血再灌注損傷等方面的研究。Cao[12]等在脊髓缺血模型中報(bào)道，黃芩苷能顯著抑制大鼠脊髓缺血誘導(dǎo)的促凋亡基因Bax的表達(dá)，而增加抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，并能顯著抑制caspase-3的產(chǎn)生，從而大大降低大鼠脊髓缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。Tu[13]等在腦缺血的模型中發(fā)現(xiàn)，黃芩苷能減少大鼠腦缺血誘導(dǎo)的caspase-3的產(chǎn)生，并能抑制IL-1β、TNF-α、iNOS、COX-2等炎癥因子的產(chǎn)生。本研究采用KA誘導(dǎo)小鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)模型，探討黃芩苷對(duì)小鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)后海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響發(fā)現(xiàn)，與SE組相比，黃芩苷治療組能顯著減少小鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)后海馬組織中促凋亡基因Bax的表達(dá)，增加抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)。為了進(jìn)一步證實(shí)黃芩苷的抗凋亡作用，我們檢測(cè)了凋亡因子caspase-3——是檢測(cè)凋亡的一個(gè)重要指標(biāo)，在細(xì)胞凋亡的蛋白酶級(jí)聯(lián)切割途徑中處于核心位置，發(fā)現(xiàn)癲癇發(fā)作后caspase-3含量較對(duì)照組明顯增多，經(jīng)黃芩苷治療后caspase-3含量顯著減少，二者之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜上所述，黃芩苷能夠抑制小鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)后海馬神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，其作用機(jī)制可能通過(guò)上調(diào)Bcl-2的表達(dá)和下調(diào)Bax、caspase-3的表達(dá)有關(guān)。其具體作用途徑有待進(jìn)一步研究。

表3 Western blot檢測(cè)Bcl-2、Bax及caspase-3蛋白在不同組別的相對(duì)表達(dá)量(±s)

表3 Western blot檢測(cè)Bcl-2、Bax及caspase-3蛋白在不同組別的相對(duì)表達(dá)量(±s)

1）經(jīng)Bonferroni檢驗(yàn)，與對(duì)照組比較，P＜0.05；2)經(jīng)Bonferroni檢驗(yàn)，與SE組比較，P＜0.05

組別SE組黃芩苷治療組對(duì)照組n6 6 6 Bcl-2/β-actin 0.6993±0.0078 1.2423±0.04691）2）0.8200±0.0682 Bax/β-actin 1.2099±0.27851）0.6216±0.16501）2）0.4483±0.0636 Caspase-3/β-actin 1.4149±0.11971）1.0138±0.05281）2）0.6292±0.0795

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OUYANG Longqiang, YANG Shaochun, ZOU Lliansheng，LIANG Risheng, LIU Dehua, GAO Ziqiang, CHENG Wei.,
Department of Neurosurgery，The firstAf filiated Hospital ofGannan Medical College，Ganzhou 341000,China.Tel:0797-8269514.

ObjectiveMethodsResultsConclusions

Epilepsy Baicalin Kainic acid Apoptosis

R742.1

A

2013-11-07）

（責(zé)任編輯:甘章平）

10.3936/j.issn.1002-0152.2014.05.003

*贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科（贛州341000）

△福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)外科