法舒地爾聯(lián)合谷氨酸降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活率☆

陳舒 羅銘 蔡望青 何明亮 陳美惠 劉安民

法舒地爾聯(lián)合谷氨酸降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活率☆

陳舒*羅銘**蔡望青*何明亮*陳美惠△劉安民*

目的 觀察Rho激酶抑制劑法舒地爾對膠質(zhì)瘤細(xì)胞NMDAR-1表達(dá)和聯(lián)合谷氨酸降低細(xì)胞存活率。方法使用法舒地爾干預(yù)原代人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞48h后再加入谷氨酸共同培養(yǎng)細(xì)胞24h。相差顯微鏡觀察法舒地爾對細(xì)胞形態(tài)變化的影響；噻唑藍(lán)(MTT)比色法檢測細(xì)胞的存活率；免疫熒光和蛋白質(zhì)印跡檢測谷氨酸受體的表達(dá)變化。結(jié)果經(jīng)過法舒地爾干預(yù)48h后，免疫熒光（NMDAR-1陽性細(xì)胞百分比計(jì)數(shù)：空白對照組18.9%±3.7%,Fas100μmol/L組79.4%±6.4%,P＜0.05）和蛋白質(zhì)印跡表明谷氨酸受體的表達(dá)明顯升高（Fas50μmol/ L組相對密度：Blank組4.07±1.04倍，P＜0.05，F(xiàn)as100μmol/L組為4.89±0.96倍，P＜0.05），谷氨酸能明顯降低經(jīng)法舒地爾處理后的細(xì)胞的存活率（空白對照組與空白對照+谷氨酸組吸光度分別為1.47±0.11和1.34±0.20，P＞0.05；Fas50μmol/L組和Fas50μmol/L+谷氨酸組為0.98±0.16和0.66±0.15，P＜0.05；Fas100μmol/L組和Fas100μmol/ L+谷氨酸組為0.89±0.13和0.49±0.17，P＜0.05）。結(jié)論法舒地爾可以誘導(dǎo)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞谷氨酸受體的表達(dá)增高，從而可以聯(lián)合谷氨酸發(fā)揮谷氨酸興奮性毒性達(dá)到更好的抗膠質(zhì)瘤的作用。

法舒地爾 膠質(zhì)瘤 谷氨酸 NMDAR-1

腦膠質(zhì)瘤是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)腫瘤，目前對于膠質(zhì)瘤的治療仍然不能取得滿意的療效。目前對于膠質(zhì)瘤的治療已經(jīng)有了很多發(fā)現(xiàn)，其中法舒地爾作為唯一應(yīng)用于臨床上的Rho激酶抑制劑被廣泛應(yīng)用于蛛網(wǎng)膜下腔出血、腦缺血等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療中[1,2]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)[3,4]，法舒地爾可明顯誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株的細(xì)胞凋亡、抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長。N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptor,NMDAR)是細(xì)胞谷氨酸受體的一種亞型，能引起鈣離子通道開放，鈣離子內(nèi)流使得細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載，造成細(xì)胞凋亡[5]，這可能作為膠質(zhì)瘤治療的一個(gè)新的靶點(diǎn)[6]。但是人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞缺乏谷氨酸受體[7-9]，因此如何增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中谷氨酸受體的表達(dá)使之成為治療靶點(diǎn)是目前急需解決的問題。原代培養(yǎng)的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞保留原來的遺傳特性,最接近和反映體內(nèi)生長特性,是理想的基因表達(dá)和藥物毒性體外試驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚10]。因此，在本研究中我們應(yīng)用法舒地爾誘導(dǎo)人腦膠質(zhì)瘤原代細(xì)胞表達(dá)NMDAR-1的情況，并聯(lián)合谷氨酸探討抗膠質(zhì)瘤的可能作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤標(biāo)本來自中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院神經(jīng)外科，術(shù)前經(jīng)患者知情同意，術(shù)后病理診斷為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（WHOⅣ）。DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清（Gibco公司）；二甲基亞砜（DMSO），Hochest 33258，谷氨酸（Glu）和噻唑藍(lán)（MTT）（美國Sigma公司，谷氨酸純度＞98%）；法舒地爾（大連美倫，純度＞98%）；兔多克隆抗NMDAR1抗體（武漢博士德）；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗（Thermo Scientific公司）；Alexa 555標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗，青霉素-鏈霉素，RIPA裂解液，TritonX-100（碧云天）；PVDF膜（Millipore公司）；激光共聚焦顯微鏡，CK2型倒置相差顯微鏡（Olympus，日本）；酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤標(biāo)本進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)取下標(biāo)本后1h內(nèi)浸泡在含1%青霉素-鏈霉素的PBS中，小心去除組織上的血管、腦膜等非腫瘤組織。將組織剪成大小約為1cm3的小塊，0.25%胰酶消化10～15min。吸取上清，向上清液中加入含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMED培養(yǎng)液，1200 r/min離心5min后棄上清，加入相同培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。將細(xì)胞以每毫升105個(gè)密度接種于培養(yǎng)瓶中，置于5%CO2、37℃的恒溫箱中培養(yǎng)24h后換液，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到90%融合度時(shí)傳代。

1.3 法舒地爾干預(yù)膠質(zhì)瘤細(xì)胞將細(xì)胞接種到48孔板上，培養(yǎng)24h后分別加入不同濃度的法舒地爾（F）處理細(xì)胞，設(shè)立空白對照組（單純DMEM）、法舒地爾50μmol/L、法舒地爾100μmol/L，并每組設(shè)立2個(gè)副孔，48h后鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化。

1.4 MTT比色法檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞的存活率人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞以2×103個(gè)/孔接種于96孔板上，24h后用含不同濃度的法舒地爾（0，50，100 μmol/L）的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞48h，每個(gè)濃度設(shè)12個(gè)孔培養(yǎng)細(xì)胞。取各濃度6個(gè)孔加入50 mmol/L的谷氨酸溶液1μL，使谷氨酸終濃度為500μmol/L，其余6個(gè)孔加入1μL PBS繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24h，每組有6個(gè)副孔。向各孔加入5g/L,10μL的MTT溶液培養(yǎng)4h，然后小心吸去液體，向每孔中加入100μL DMSO，15 min后用酶標(biāo)儀在570 nm下檢測吸光度（OD值）。

1.5 WesternBlot檢測NMDAR-1的表達(dá)將不同濃度的法舒地爾與人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞培養(yǎng)48h后，吸去上清液，用PBS洗3次，加入RIPA裂解液提取蛋白。最終蛋白上樣量為20μg，用8%分離膠進(jìn)行十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺(SDS—PAGE)凝膠電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)膜到PVDF膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉1h，用兔多克隆抗NMDAR-1抗體（1：400稀釋）4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次5min，再將膜置入HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(1：10000稀釋)室溫反應(yīng)1 h。洗膜后用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)法在顯影儀下顯影。Western Blot條帶應(yīng)用Quantity One軟件進(jìn)行灰度分析。

1.6 免疫熒光檢測細(xì)胞連接處NMDAR-1的表達(dá)法舒地爾培養(yǎng)細(xì)胞48h后，吸去培養(yǎng)液，用PBS洗3次。用4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞15min，PBS洗凈多聚甲醛后加入0.3%TritonX-100透膜15min。洗凈TritonX-100，加入正常山羊血清室溫封閉1h，再加入兔多克隆抗NMDAR-1抗體（1：200稀釋）4℃孵育過夜。吸去NMDAR-1抗體，PBS洗3次，避光加入Alexa 555標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗（1：500稀釋）室溫1h，PBS洗凈抗體，加入Hochest 33258（1：1000稀釋）室溫10min，用PBS洗凈細(xì)胞。封片，上機(jī)檢測。隨機(jī)選取3個(gè)視野進(jìn)行NMDAR-1陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算陽性細(xì)胞所占比例。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 13.0分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。單因素方差分析(Oneway ANOVA)進(jìn)行組間數(shù)據(jù)比較，兩組之間比較用Dunnett’t檢驗(yàn)，檢測水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同法舒地爾濃度對膠質(zhì)瘤細(xì)胞形態(tài)的影響法舒地爾培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞72h后，細(xì)胞胞體變細(xì)、變圓、變小，細(xì)胞核固縮數(shù)量增加，皺褶增多，細(xì)胞突起增多且纖細(xì)，并且細(xì)胞間的連接增多。這種變化具有濃度依賴性，法舒地爾高濃度（100 μmol/L）較稍低濃度（50μmol/L）的細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變更加顯著，見圖1。

2.2 谷氨酸降低經(jīng)法舒地爾處理后細(xì)胞的存活率MTT法檢測顯示，空白對照組吸光度OD值（1.47± 0.11）與空白對照+谷氨酸組（1.34±0.20）相比，無明顯變化（P＞0.05）；而法舒地爾50μmol/L+谷氨酸組OD值（0.66±0.15）與法舒地爾50μmol/L組OD值（0.98±0.16）相比明顯下降（P＜0.05）；法舒地爾100μmol/L+谷氨酸組OD值（0.49±0.17）與法舒地爾100μmol/L組OD值（0.89±0.13）相比明顯下降（P＜0.05）。并且與空白對照組相比，法舒地爾50μmol/L組（P＜0.05）和法舒地爾100μmol/L組的OD值明顯下降（P＜0.05）。

2.3 法舒地爾對膠質(zhì)瘤細(xì)胞谷氨酸受體NMDAR-1蛋白的影響經(jīng)法舒地爾100μmol/L作用于膠質(zhì)瘤細(xì)胞48h后做Western blot檢測谷氨酸受體NMDAR-1表達(dá)的變化，結(jié)果顯示：Fas 50μmol/L組相對密度為空白對照（Blank）組4.07±1.04倍（P＜0.05），F(xiàn)as 100μmol/L組為4.89±0.96倍（P＜0.05），見圖2。

2.4 免疫熒光檢測高濃度法舒地爾對谷氨酸受體NMDAR-1的表達(dá)變化空白對照組（Blank）中細(xì)胞內(nèi)NMDAR-1的表達(dá)量十分低，經(jīng)法舒地爾100μmol/L(Fas 100)處理48h后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中NMDAR-1的表達(dá)明顯增高，尤其是在細(xì)胞連接處的表達(dá)增高明顯。這與Western blot的結(jié)果相一致，見圖3。NMDAR-1陽性細(xì)胞百分比計(jì)數(shù)結(jié)果為：Fas 100μmol/L組79.4%±6.4%較空白對照組18.9%±3.7%明顯升高（P＜0.05）。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，Rho/ROCK通路在細(xì)胞活動(dòng)如細(xì)胞骨架的重構(gòu)、細(xì)胞分化和遷徙、細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用[1,2,11]。ROCK(Rho kinase)的過度激活可導(dǎo)致多種疾病，ROCK的抑制能逆轉(zhuǎn)各自病理過程，因此對ROCK抑制劑的研究有著重要的意義，而法舒地爾是目前臨床上惟一可用的ROCK抑制劑。

Rho/ROCK信號(hào)通路是膠質(zhì)瘤發(fā)生的重要機(jī)制之一。ROCk有兩個(gè)亞型，即ROCK 1和ROCK 2，在膠質(zhì)瘤組織中，兩者的表達(dá)較正常腦組織中高，并且ROCK 1和ROCK 2在膠質(zhì)瘤的增殖、遷移、侵襲過程中發(fā)揮著不同的作用。其中選擇性抑制ROCK 1能降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和增殖，而抑制ROCK 2能加強(qiáng)抑制ROCK 1所起到的抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的作用[12]。作為ROCK抑制劑，法舒地爾可以同時(shí)抑制ROCK 1和ROCK 2，從而發(fā)揮抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用[4]。在本實(shí)驗(yàn)中，膠質(zhì)瘤細(xì)胞經(jīng)過法舒地爾處理48h后，應(yīng)用MTT法檢測細(xì)胞存活率發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，單純法舒地爾組能夠明顯降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞的存活率(P＜0.05)。

目前有研究表明，谷氨酸能夠通過作用于細(xì)胞膜上NMDAR引起鈣離子通道開放，鈣離子內(nèi)流使得細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載，造成細(xì)胞凋亡[5]。作為谷氨酸信號(hào)通路中最重要的組成成分NMDAR，最初被發(fā)現(xiàn)與突觸的可塑性和記憶密切相關(guān)[13]。近期研究認(rèn)為谷氨酸相關(guān)的信號(hào)通路可能是治療腫瘤的一個(gè)新的靶點(diǎn)[6]。由于人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中NMDAR的表達(dá)量很低[7]，因此谷氨酸無法對膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)揮興奮性毒性引發(fā)細(xì)胞凋亡。膠質(zhì)瘤細(xì)胞自身可以分泌谷氨酸使腫瘤周圍正常的膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞死亡[14]，從而更好的發(fā)揮自身的侵襲性。鑒于此，如果可以誘導(dǎo)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中NMDAR的表達(dá)增高，則細(xì)胞自身分泌的谷氨酸也會(huì)對本身造成殺傷，同時(shí)NMDAR也可以作為殺傷膠質(zhì)瘤細(xì)胞的一個(gè)可能的治療靶點(diǎn)。

圖1 不同濃度法舒地爾對膠質(zhì)瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響。Blank：空白對照組；Fas 50:法舒地爾50μmol/L組；Fas 100:法舒地爾100μmol/L組。放大倍數(shù)200×，標(biāo)尺50μm

圖2 法舒地爾對膠質(zhì)瘤細(xì)胞谷氨酸受體NMDAR-1蛋白的影響。Blank：空白對照組；Fas 50:法舒地爾50μmol/L組；Fas 100:法舒地爾100μmol/L組，n=3

圖3 疫熒光檢測高濃度法舒地爾谷氨酸受體NMDAR-1的表達(dá)變化。Blank：空白對照組；Fas100:法舒地爾100μmol/L組，n=3

本研究中，我們通過蛋白質(zhì)印跡和免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)經(jīng)法舒地爾處理后的NMDAR-1的表達(dá)明顯增高，并且MTT法檢測細(xì)胞存活率發(fā)現(xiàn)，向經(jīng)法舒地爾處理后的細(xì)胞中加入谷氨酸能進(jìn)一步的降低細(xì)胞的存活率(P＜0.05)，而谷氨酸無法影響未經(jīng)法舒地爾處理的細(xì)胞存活率。由此我們推斷，法舒地爾能夠誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中NMDAR-1的表達(dá)增高(P＜0.05)，克服了NMDAR作為膠質(zhì)瘤治療靶點(diǎn)的最大阻礙，從而可以聯(lián)合谷氨酸的興奮性毒性發(fā)揮更好的抗膠質(zhì)瘤的作用。因此，本研究結(jié)果提示，法舒地爾可以誘導(dǎo)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞谷氨酸受體的表達(dá)增高，聯(lián)合谷氨酸發(fā)揮谷氨酸興奮性毒性達(dá)到更好的抗膠質(zhì)瘤的作用，NMDAR可能是膠質(zhì)瘤治療的靶點(diǎn)之一。

[1] Chen M,Liu A,Ouyang Y,et al.Fasudil and its analogues:a new powerful weapon in the long war against central nervous system disorders?[J].Expert Opin Investig Drugs，2013,22(4): 425-438.

[2] 陳美惠，劉安民，巢曉娟，等.Rho激酶抑制劑法舒地爾對中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病作用及其結(jié)構(gòu)改造的研究進(jìn)展[J].中國新藥雜志.2013,22(1):59-67.

[3] Yamaguchi S,Tanabe K,Takai S,et al.Involvementof Rho-kinase in tumor necrosis factor-alpha-induced interleukin-6 release from C6 glioma cells[J].Neurochem Int，2009,55(6):438-445.

[4] Deng L,Li G,Li R,et al.Rho-kinase inhibitor,fasudil,suppresses glioblastoma cell line progression in vitro and in vivo [J].Cancer Biol Ther，2010,9(11):875-884.

[5] Deiva K,Geeraerts T,Salim H,et al．Fraetalkine reduces N-methyl-d-aspartate-induced calcium flux and apoptosis in human neurons through extraeellular signal-regulated kinase activation[J].Eur JNeurosci,2004,20(12):3222-3232.

[6] Willard SS,Koochekpour S.Glutamate Signaling in Benign and Malignant Disorders:Current Status,Future Perspectives,and Therapeutic Implications[J].Int JBiol Sci，2013,9(7):728-742.

[7] Lyons SA,Chung WJ,Weaver AK,et al.Autocrine glutamate signaling promotes glioma cell invasion[J].Cancer Res,2007, 67(19):9463–9471.

[8] Roesler R,Brunetto AT,Abujam ra AL,et al.Current and emerging molecular targets in glioma[J].Expert Rev.Anticancer Ther,2010,10(11):1735–1751.

[9] Vanhoutte N,Hermans E.Glutamate-induced glioma cellproliferation is prevented by functional expression of the glutamate transporter GLT-1[J].FEBSLett,2008,582(13),1847–1852.

[10] 檀艷麗,方川,王雷鳴,等.人腦膠質(zhì)瘤原代細(xì)胞培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察[J].中國神經(jīng)精神疾病雜志,2010.36(8):501-503.

[11] Shi J,Wei L.Rho kinase in the regulation of cell death and survival[J].Arch Immunol Ther Exp(Warsz),2007,55(2):61-75.

[12] Sonja Mertsch,Solon Thanos.Opposing Signaling of ROCK1 and ROCK2 Determines the Switching of Substrate Specificity and the Mode ofMigration of Glioblastoma Cells[J].Mol Neurobiol,2014,49（2）：900-915.

[13] Li F,Tsien JZ.Memory and the NMDA receptors[J].N Engl J Med,2009,361(3):302-303.

[14] Malarkey EB,Parpura V.Mechanisms of glutamate release from astrocytes[J].Neurochem Int,2008,52(1-2):142-154.

R394.2

A

2014-02-25）

（責(zé)任編輯:甘章平）

10.3936/j.issn.1002-0152.2014.06.010

☆廣東省科技社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目（編號(hào)：2012B031800356）資助

*中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院神經(jīng)外科（廣州510120）

**腫瘤科

△中山大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)與毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)室