高產(chǎn)蛋白酶活性的枯草芽孢桿菌篩選及鑒定

程德勇，繆禮鴻

(武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢430023)

蛋白酶是一類廣泛應(yīng)用于食品、紡織、醫(yī)藥、有機合成、洗滌劑及制革脫毛等方面的重要工業(yè)和研究用酶，其份額占整個酶制劑市場的一半以上。最大的用途是洗滌劑，其次用于飼料、食品工業(yè)、以及制革工業(yè)。蛋白酶既可以從動植物組織中提取，也可以通過微生物發(fā)酵工藝進行生產(chǎn)。目前生產(chǎn)蛋白酶制劑主要利用曲霉、芽孢桿菌等微生物發(fā)酵制備。隨著蛋白酶應(yīng)用的日趨廣泛和需求的日益增多，分離篩選能分泌具有良好酶學(xué)特性并適用大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的蛋白酶高產(chǎn)菌株，是廣大科研人員的研究目標和任務(wù)［1-2］。

本實驗結(jié)合透明圈法和福林-酚試劑法［3］從土壤中篩選得到1株產(chǎn)蛋白酶能力強于當(dāng)前市場上三種枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑。通過16S rRNA基因測序及進化樹繪制對該菌株進行了分類學(xué)鑒定。擬為具有高蛋白酶活性飼料添加劑的研發(fā)提供參考菌株。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 土樣

1號土樣和2號土樣均采自武漢輕工大學(xué)校園內(nèi);3號土樣采自武漢市黃陂區(qū)。

1.1.2 用于對比的枯草芽孢桿菌菌種:

宜昌某公司畜禽養(yǎng)殖用枯草芽孢桿菌(A菌)和活性凈水用枯草芽孢桿菌(B菌);武漢某公司飼用枯草芽孢桿菌(C菌)，以上菌劑均為市購。

1.1.3 培養(yǎng)基

脫脂牛奶固體培養(yǎng)基［4］:牛肉膏 3 g/L;蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，脫脂奶粉 1.5%;瓊脂 1.5%—2.0%，水 1 L，pH 7.2—7.4。脫脂奶粉先配 15%100 mL分裝5瓶20 mL/100 mL錐形瓶，112℃，滅菌30 min;其他成分配900 mL分裝5瓶180 mL/500 mL錐形瓶，121℃，滅菌20 min。倒平板之前，兩者混合，搖勻;保藏菌種使用斜面培養(yǎng)基:蛋白胨10 g/L;牛肉膏5 g/L;NaCl 5 g/L;瓊脂 1.5%—2.0%;水 1 L;pH 7.2—7.4，使用試管制作斜面;活化培養(yǎng)基:蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂 1.5%—2.0%，水 1 L，pH 7.2—7.4;種子培養(yǎng)基:蛋白胨 10 g/L，牛肉膏 5 g/L，NaCl 5 g/L，水 1 L，pH 7.2—7.4;發(fā)酵培養(yǎng)基［5］:蛋白胨 10 g/L;牛肉膏5 g/L;蔗糖10 g/L;磷酸氫二鈉4 g/L;硫酸鎂 0.2 g/L;水 1 L;pH 7.2。

以上培養(yǎng)基都為121℃，滅菌20 min。

1.2 實驗試劑

配制培養(yǎng)基的各種原料、試劑及孔雀綠染料。

測中性蛋白酶酶活所需試劑:福林-酚試劑;0.4 mol/L三氯乙酸(TCA)溶液;0.4 mo1/L碳酸鈉溶液;磷酸緩沖液(pH=7.5);0.5 mol/L 的 NaOH;10.00 mg/mL 酪素溶液:稱取酪素 1.000 g，準確至0.001 g，用少量的0.5mol/L的氫氧化鈉溶液(若為酸性蛋白酶則用濃乳酸2—3滴)潤濕，加入適量的各適宜的緩沖液約80 mL，在沸水浴中邊加熱邊攪拌，直至完全溶解，冷卻后，轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，用適宜的緩沖液稀釋至刻度，此溶液在冰箱內(nèi)貯存，有效期為3 d;100μg/mL酪氨酸標準溶液:準確稱取預(yù)先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.100 0 g，用1 mol/L的鹽酸60 mL溶解后定容至100 mL，即1.00 mg/mL的酪氨酸溶液。吸取1.00 mg/mL酪氨酸標準溶液 10.00 mL，用 0.1 mol/L鹽酸定容至100 mL，即得 100.0 μg/mL L-酪氨酸標準溶液。

16S rRNA基因測序菌種鑒定所需試劑:Ezup柱式細菌基因組DNA抽取試劑盒(購買于上海生工生物工程有限公司);16S rRNA基因PCR擴增引物:1492r:5’-ggttaccttgttacgactt-3’、27f:5’-agagttgatcctggctcag-3’［6］;Premix Taq 酶(含 DNA Polymerase，dNTP Mixture，PCR Buffer。購于大連寶生物工程有限公司);10×loading Buffer;50×TAE(用時稀釋成1×TAE);瓊脂糖;EB;D15000 DNA Maker。

1.3 實驗方法

1.3.1 產(chǎn)蛋白酶枯草芽孢桿菌的篩選分離

用無菌小鏟從三個不同地點取地表下10—15 cm處的土壤，裝入紙袋中并做標記。每個土樣取1 g倒入含9 mL無菌水的試管中，搖勻后放入80℃恒溫水浴鍋中處理20 min，然后搖勻稀釋，分別取10－4，10－5，10－6三個稀釋度涂布到篩選平板中，每個稀釋度做3個重復(fù)，倒置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。觀察平板上菌落周圍的透明圈，并計算出(H/C)比值，標號作好記錄。將涂布平板中具有透明圈的菌落在脫脂牛奶平板上進行劃線分離純化。最后將分離出的單菌落接種到斜面培養(yǎng)基中，于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，放入冰箱中4℃保藏。

1.3.2 L-酪氨酸標準曲線的繪制

L-酪氨酸標準溶液按表1配制。

表1 L-酪氨酸標準溶液制備

分別取上述溶液各1.00 mL(須做平行試驗)，各加0.4 mol/L碳酸鈉溶液5.00 mL后，再加入福林-酚試劑1.00 mL，搖勻置于40±0.2 ℃水浴鍋中顯色20 min后，用分光光度計于波長680 nm比色，以不含酪氨酸的0管為空白管調(diào)零點，分別測定其吸光度值，以吸光度值為縱坐標，酪氨酸的濃度為橫坐標，繪制標準曲線并計算回歸方程。計算出當(dāng)OD為1時的酪氨酸的量(μg)，即為吸光常數(shù)K值，其K值應(yīng)在95-100范圍內(nèi)。

1.3.3 中性蛋白酶活性測定

將 A，B，C，和篩選出的 CDY-1，CDY-2，CDY-3，CDY-4，CDY-5，CDY-6 菌株，活化接種子液后，以3%(V/V)的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基(100 mL/250 mL)，37℃、170 r/min培養(yǎng)48 h。按照國標福林-酚試劑法測定出這九株菌發(fā)酵液中性蛋白酶活性。比較這九株菌發(fā)酵液中性蛋白酶活性大小，選出中性蛋白酶活性強于菌株A，B，C的細菌及透明圈(H/C)值大的菌株CDY-1做芽孢染色實驗。

1.3.4 16S rRNA基因測序進行菌種鑒定

按照試劑盒DNA提取操作手冊提取CDY-1，CDY-5菌的基因組DNA。

16S rRNA基因PCR擴增:以提取出的細菌基因組 DNA為模板，配置50μL PCR反應(yīng)體系:Premix Taq 25 μL，模板 2 μL，引物1492r 1 μL，引物27f 1 μL，ddH2O 21 μL。

16S rRNA基因PCR反應(yīng)條件:94℃，5 min;(94℃，50 s;54℃，50 s;72 ℃，1 min 30 s)30個循環(huán);72 ℃、10 min。

取10μL 16S rRNA基因PCR反應(yīng)液進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳30 min后，用EB染色15 min并用凝膠成像系統(tǒng)進行拍照核對DNA擴增片段大小，最后取20μL 16S rRNA基因PCR反應(yīng)液于1.5 mL EP管中，送至金唯智生物科技(北京)有限公司進行測序。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)蛋白酶芽孢桿菌篩的選結(jié)果

2.1.1 菌落透明圈圖片

從三種土壤樣品中共分離獲得20株水解圈較大的芽孢桿菌菌株，含菌落透明圈的脫脂牛奶固體培養(yǎng)基平板圖片如圖1所示。

圖1 篩選出含透明圈的單菌落平板圖

2.1.2 篩選出的20株產(chǎn)蛋白酶芽孢桿菌透明圈(H/C)值

由表2可得，菌株CDY-1透明圈(H/C)值為3.75最大，因此對菌株CDY-1先做芽孢染色觀察其形態(tài)，再進行16S rRNA基因測序鑒定該菌株，并選擇透明圈(H/C)值在3.00以上的六株菌進行液體發(fā)酵，測定其發(fā)酵液分泌的蛋白酶活性。

表2 20株產(chǎn)蛋白酶芽孢桿菌透明圈(H/C)值

2.2 中性蛋白酶活性測定結(jié)果

L-酪氨酸標準曲線測定與繪制結(jié)果分別如表3和圖2所示。

表3 繪制L-酪氨酸標準曲線的數(shù)據(jù)表

圖2 L-酪氨酸標準?曲線

以吸光度OD值為縱坐標，酪氨酸濃度為橫坐標，繪制L-酪氨酸標準曲線如圖2。其線性回歸方程式為:y=0.0102x+0.004，相關(guān)系數(shù) R2=0.999 7。當(dāng)y=1時 ，K=x=97.65。測得的K值在95—100范圍內(nèi)，表明具有一定準確性。

樣品中性蛋白酶活性測定結(jié)果如表4。

表4 樣品中性蛋白酶活性測定結(jié)果

由表4得菌株CDY-6在此液體發(fā)酵培養(yǎng)基條件下沒有分泌蛋白酶，測出的結(jié)果為0，表明固體平板上測定的透明圈(H/C)值與液體培養(yǎng)條件下菌株的蛋白酶活性具有一定的相關(guān)性，但不一定完全一致，因為固體培養(yǎng)基與液體發(fā)酵培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分不同。菌株A、B、C在此發(fā)酵培養(yǎng)基中分泌的蛋白酶活力分別為 15.31 U/mL，9.84 U/mL，8.44 U/mL。菌株CDY-5的發(fā)酵液酶活力為23.44 U/mL，是這九株菌中酶活力最強的一株，故選擇菌株CDY-5先做芽孢染色觀察其形態(tài)，然后進行16S rRNA基因測序來鑒定該菌株。

2.3 芽孢桿菌分類鑒定結(jié)果

2.3.1 芽孢染色結(jié)果

CDY-1菌芽孢染色結(jié)果如圖3所示，CDY-5菌芽孢染色結(jié)果如圖4所示。

圖3 CDY-1菌芽孢染色在顯微鏡10×100倍圖

圖4 CDY-5菌芽孢染色在顯微鏡10×100倍圖

如圖3，4所示，綠色為芽孢，紅色為細菌細胞。有的全為紅色表明還沒有產(chǎn)生芽孢，有的菌體中間為綠色兩頭為紅色表明已經(jīng)在細胞內(nèi)產(chǎn)生了芽孢，有的全為綠色表明已經(jīng)形成了完整的芽孢。由此表明，菌株CDY-1和CDY-5均為芽孢桿菌。比較兩圖可知，菌株CDY-1菌體大小比菌株CDY-5的大。

2.3.2 16S rRNA基因PCR擴增結(jié)果

菌株CDY-1和CDY-5 16S rRNA基因PCR擴增后瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖5所示。

圖5 16S rRNA基因PCP擴增后瓊脂糖凝膠電泳圖

由圖5可知，兩菌株16S rRNA基因 PCR產(chǎn)物大小都在1.5 kb左右，說明此次PCR擴增產(chǎn)物為16S rRNA基因，送測序公司測序。

2.3.3 16S rRNA基因測序和菌種鑒定結(jié)果

將菌株CDY-1的16S rRNA基因序列在NCBI官網(wǎng)中使用Nucleotide BLAST比對，選取9株菌種使用MEGA構(gòu)建菌株CDY-1系統(tǒng)發(fā)育樹如圖6所示。

由圖6系統(tǒng)發(fā)育樹分析可得菌株CDY-1為巨大芽孢桿菌，與菌株CDY-1芽孢染色結(jié)果相符合。

圖6 CDY-1菌系統(tǒng)發(fā)育樹

將菌株CDY-5的16S rRNA基因序列在NCBI官網(wǎng)中使用Nucleotide BLAST比對，選取12株菌種使用MEGA軟件構(gòu)建菌株CDY-5的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖7。

圖7 CDY-5菌系統(tǒng)發(fā)育樹

由圖7系統(tǒng)發(fā)育樹分析可得出菌株CDY-5為枯草芽孢桿菌，與菌株CDY-5芽孢染色結(jié)果相符合。

3 結(jié)束語

本實驗通過80℃水浴處理土壤樣品溶液，再進行稀釋，涂布到含脫脂奶粉的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，篩選出20株能分泌胞外蛋白酶的芽孢桿菌。選擇透明圈(H/C)值排名前6位及宜昌某公司畜禽枯草芽孢桿菌(標A菌)，活性凈水枯草芽孢桿菌(標B菌)，武漢某公司飼用枯草芽孢桿菌(標C菌)進行活化，接種，液體發(fā)酵，使用福林酚試劑法測定發(fā)酵菌液中性蛋白酶活性。比較結(jié)果后，選擇蛋白酶活性比A菌(發(fā)酵菌液蛋白酶活性15.31 U/mL)，B菌(9.84 U/mL)，C 菌(8.44 U/mL)都強的菌株CDY-5(23.44 U/mL)及透明圈(H/C)值最大的菌株CDY-1(H/C值為3.75)，進行芽孢染色觀察及16S rRNA基因測序鑒定菌種。使用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析得出菌株CDY-1為巨大芽孢桿菌，菌株CDY-5為枯草芽孢桿菌。菌株CDY-1和CDY-5芽孢染色結(jié)果與16S rRNA基因測序鑒定菌種結(jié)果相符。

本實驗的結(jié)果表明，所篩選出了一株枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶活性(23.44 U/mL)，比產(chǎn)品化的宜昌某公司畜禽枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶活性(15.31 U/mL)強。國內(nèi)外文獻報道枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶活力的有許多，Valeria F.Soares等報道枯草芽孢桿菌液體發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶活力為120 U/mL［7］;張士偉等優(yōu)化培養(yǎng)基后，枯草芽孢桿菌BS3蛋白酶活力為162.309 U/mL［8］;由此可見，本研究篩選出的枯草芽孢桿菌CDY-5產(chǎn)蛋白酶的活力不是很高。為了盡可能提高此株枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的活力，還需進一步對此株枯草芽孢桿菌進行誘變育種，并對發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化。

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