蒽酮-硫酸分光光度法測定五味子中總多糖含量

徐小娜，魯 岐，宋鳳瑞，黃海龍

(1.南華大學(xué)，湖南 衡陽421001；2.大連富生天然藥物開發(fā)有限公司，遼寧 大連 116600；3.中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所，吉林 長春130022)

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蒽酮-硫酸分光光度法測定五味子中總多糖含量

徐小娜1，魯 岐2，宋鳳瑞3*，黃海龍1

(1.南華大學(xué)，湖南 衡陽421001；2.大連富生天然藥物開發(fā)有限公司，遼寧 大連 116600；3.中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所，吉林 長春130022)

通過單因素實(shí)驗(yàn)選擇和正交設(shè)計(jì)對五味子中多糖進(jìn)行超聲輔助提取，以吸光度值為指標(biāo)，分別對料液比、提取溫度、提取時間和提取次數(shù)等因素進(jìn)行考察，優(yōu)化出超聲輔助提取五味子多糖的最佳條件為料液比1∶30、提取時間40min、溫度60℃、提取次數(shù)為1次。在優(yōu)化的條件下對湖北和遼寧產(chǎn)的五味子中總多糖含量進(jìn)行測定，得出北五味子總多糖含量為39.31mg/g，南五味子總多糖含量為24.05mg/g，二者多糖含量存在顯著性差異。

五味子；蒽酮-硫酸；多糖；含量測定

五味子(Schisandrachinesis(Turcz).Bail)為木蘭科植物五味子的干燥成熟果實(shí)，味酸、性甘溫，具有收斂固澀、生津止渴、寧心安神、興奮呼吸、調(diào)節(jié)血壓、增強(qiáng)視力及改善智力等多種功效[1]。其主要成分為揮發(fā)油、木脂素、多糖等[2,3]。多糖是五味子重要的活性成分，具有補(bǔ)腎養(yǎng)心、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、抗腫瘤、抗肝炎、調(diào)血脂、降血糖、抗衰老等多方面的藥理作用[4-6]。

本實(shí)驗(yàn)采用超聲波輔助提取技術(shù)，以吸光度值為考察指標(biāo)，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過正交實(shí)驗(yàn)對五味子多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并利用蒽酮—硫酸分光光度法測定[8]五味子中總多糖含量，為五味子多糖的深入研究提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

乙醇、濃硫酸、葡萄糖均為分析級，蒽酮(上海隆壘生物科技有限公司)，五味子藥材信息見表1。

島津UV-2550型紫外可見分光光度計(jì)(日本島津公司)，KQ-2200DE 型數(shù)控超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，800B 型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，101-2 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(北京科威儀器有限公司)。

表1 五味子藥材信息

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 硫酸-蒽酮溶液制備 精密稱取蒽酮0.1g，用80%硫酸溶液溶解，配成100mL溶液，備用。

1.2.2 對照品溶液制備 精密稱取無水葡萄糖10mg，加入100mL容量瓶中，用蒸餾水定容，搖勻，即得0.1mg/mL的葡萄糖對照樣品溶液。

1.2.3 樣品制備 精密稱取五味子粉末0.2g于10mL比色管中，加入6mL 60%乙醇溶液作為提取劑，60℃下超聲波輔助提取40min，提取1次，過濾，收集濾液，再加80% 乙醇去脂肪，靜置沉淀后，將上層懸浮物離心(4 000r/min，30min)，取出，合并沉淀，將沉淀溶于丙酮中充分洗滌靜置過夜，沉淀再次用無水乙醇充分洗滌后，靜置，待沉淀完全后將沉淀物置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中加熱至一定體積，經(jīng)真空干燥得到五味子粗多糖，用蒸餾水溶解定容至5mL，保存于4℃冰箱，備用。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密稱取無水葡萄糖10mg于100mL容量瓶中，加蒸餾水溶解，定容后搖勻，得濃度為0.1mg/mL的葡萄糖對照液。精密吸取對照液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL，分別置于10mL具塞試管中，加蒸餾水至2.0mL使之溶解，分別加入蒽酮—硫酸儲備液6.0mL，并于熱水浴中加熱，10min后取出置于冰水浴中冷卻，10min后取出，以試劑空白為參比，于620nm處測定吸光度。以吸光度A與對應(yīng)濃度C作圖，得回歸方程為A=0.5739C+0.2248，線性范圍為2.5～15.0μg/mL，相關(guān)系數(shù)R=0.9987。

1.2.5 多糖含量測定 采用蒽酮-硫酸法測定多糖的含量。分別吸取樣品溶液適量，按“1.2.4”方法測定，并按下式計(jì)算多糖含量：多糖含量(mg/mL)=(C×Df/m)×100%。其中，C表示供試溶液中葡萄糖的含量(mg/ mL) ；D為供試溶液的稀釋倍數(shù)，f為換算因子；m代表樣品質(zhì)量(mg)。

2 結(jié)果與討論

2.1 五味子多糖提取條件的優(yōu)化

2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)

(1)提取溶劑的選擇：分別用水、甲醇、乙醇處理樣品，測定所獲溶液的吸光度值，如圖1所示。在甲醇、乙醇和水三種溶劑中，用乙醇做提取溶劑獲得的吸光度值最大，實(shí)驗(yàn)確定提取溶劑為乙醇。

(2)乙醇濃度的影響：試驗(yàn)30%、40%、50%、60%和70%五個乙醇濃度對樣品吸光度的影響(如圖2)，結(jié)果表明用60%乙醇濃度做提取劑獲得的吸光度值最大，實(shí)驗(yàn)確定乙醇濃度為60%。

圖1 不同提取溶劑所得吸光度值

圖2 乙醇濃度對吸光度的影響

(3)料液比的選擇：試驗(yàn)1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35五個不同的料液比處理樣品，測定吸光度值，所得結(jié)果如圖3所示。隨著料液比的增加，吸光度值呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，當(dāng)料液比(m/V) 為1∶30 時，吸光度值最大，當(dāng)料液比繼續(xù)增加時，吸光度值下降，故選料液比(m/V)為1∶30(g/mL)。

圖3 不同料液比的吸光度值

(4)提取時間的選擇：在樣品的提取時間分別為30、40、50、60、70min的情況下測定吸光度值，結(jié)果如圖4所示。當(dāng)提取時間為40min時，樣品的吸光度值最大，實(shí)驗(yàn)確定樣品提取時間為40min。

圖4 不同提取時間所得吸光度值

(5)提取次數(shù)的確定：選擇單因素實(shí)驗(yàn)中的最佳料液比為1∶30(60%的乙醇溶液)、提取溫度為60℃、提取時間為40min，試驗(yàn)不同提取次數(shù)對五味子多糖的影響。當(dāng)提取次數(shù)由1次、2次增加到3次時，吸光度值都有所增加，但增加程度不大，從節(jié)約試劑和提高實(shí)驗(yàn)效率等因素考慮，選擇超聲提取1次。

2.1.2 正交實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素、水平及結(jié)果見表1。在各因素中，溫度對測定結(jié)果的影響最大，其次是時間和料液比。最佳提取條件為：提取時間40min，溫度60℃，料液比1∶30。

表2 L9(33)正交試驗(yàn)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 精密度實(shí)驗(yàn) 精密量取葡萄糖對照品溶液0.5mL于10mL具塞比色管中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下自“再分別加入蒽酮-硫酸儲備液0.6mL”起操作，所得結(jié)果的RSD為0.35%(n=6)，表明儀器的精密度良好。

2.2.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批五味子樣品3 份，分別按“1.2 實(shí)驗(yàn)方法”制備多糖溶液，測定多糖含量，RSD為0.39%(n=3)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取0.1mg/mL葡萄糖溶液0.6mL于10mL具塞比色管中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)目下自“再分別加入蒽酮-硫酸儲備液0.6mL”起操作，測定0、10、20、30、40、50、60、90、120、150min的吸光度值，發(fā)現(xiàn)隨著時間的延長，吸光度值逐漸減小，因此選擇在20min內(nèi)完成測定。

2.2.4 回收率實(shí)驗(yàn) 分別精密制備3份樣品溶液0.2mL置于10mL具塞比色管中，依次添加0.1mg/mL葡萄糖溶液0.1mL、0.2mL、0.3mL，并加入水使終體積為1.0mL，空白對照為水1.0mL，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線中“再分別加入蒽酮-硫酸儲備液0.6mL”起操作測定含量，每份樣品做3次平行測定，計(jì)算回收率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，回收率為98.13%～107.97%，RSD小于5%，表明該方法的準(zhǔn)確度較高。

2.3 五味子多糖含量測定結(jié)果

七個不同來源的五味子藥材分別按“1.2”項(xiàng)下方法制備多糖溶液，按“1.2.3”項(xiàng)下自“再分別加入蒽酮-硫酸儲備液0.6mL”起操作、測定。所得結(jié)果見表3。

3 結(jié)語

本實(shí)驗(yàn)采用超聲波輔助提取技術(shù)，通過單因素實(shí)驗(yàn)選擇對五味子中多糖進(jìn)行超聲提取，以五味子中的多糖提取率為指標(biāo)，分別考察了料液比、提取溫度和提取次數(shù)等因素對提取率的影響，通過正交設(shè)計(jì)法對超聲波提取法提取五味子多糖的最佳條件進(jìn)行了優(yōu)化，最終得出：料液比(m/V)為1∶30、提取溫度為60℃、提取時間為40min、提取次數(shù)為1次。

表3 五味子多糖含量測定結(jié)果 (n=3)

注：此表中序號與表1中序號相對應(yīng)。

研究中測定了南北五味子及其五個商品藥材的總多糖，北五味子總多糖含量為39.31mg/g，南五味子總多糖含量為24.05mg/g。北五味子總多糖的含量較南五味子高，存在顯著性差異。五個商品藥材總多糖的含量處于12.38～28.51mg/g之間。發(fā)現(xiàn)將優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件應(yīng)用于實(shí)際樣品的測定，結(jié)果令人滿意，所得結(jié)果可為五味子多糖的深入研究提供參考。

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(責(zé)任編輯：魏 曉)

Determination of Total Polysaccharide in Schisandra Chinensis Turcz.Bail by Anthrone-sulfuric Acid Spectrophotometric Method

Xu Xiaona1, Lu Qi2, Song Fengrui3*, Huang Hailong1

(1.School of Public Health, University of South China, Hengyang 421001,China; 2.Dalian Fusheng natural drug development Co. Ltd., Dalian 116600,China; 3.Changchun Institute of Applied Chemistry,Chinese Academy of Sciences, Changchun 130022,China)

In this study, single factor and orthogonal design was used for ultrasonic assisted extraction of polysaccharide from Schisandra chinensis Turcz. Bail．Based on absorbance value, the solid-liquid ratio, extraction temperature, extraction time and extraction frequencies and other factors were investigated. The best conditions for the ultrasonic method to extract polysaccharide were as follows: solid-liquid ratio( m/V) was 1g∶ 30mL, extraction temperature was set at 60℃, extraction time was 40min, extracting for 1 time. Under this condition, the polysaccharide of Schisandra chinensis Turcz. Bail. from Hubei and Liaoning province were respectively detected. The results obtained show there are significant differences between the tested samples on the content of polysaccharide.

Schisandra Chinensis Turcz. Bail；Anthrone-sulfuric Acid；Polysaccharide

2014-03-20

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(11205085)；湖南省教育廳項(xiàng)目(12C0334)；衡陽市科技局項(xiàng)目(2013KJ14，2013KJ15)

徐小娜(1974-)，女，南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院講師，研究方向?yàn)橹兴幓瘜W(xué)成分分析、中藥指紋圖譜技術(shù)。

宋鳳瑞(1962-)，女，中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所研究員、博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量控制。

R282.5

A

1673-2197(2014)15-0015-03