刺玫根不同提取物體外抗氧化能力研究

劉 晶，邸子真，王光函，尤獻(xiàn)民

(遼寧省中醫(yī)藥研究院，遼寧 沈陽 110034)

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刺玫根不同提取物體外抗氧化能力研究

劉 晶，邸子真，王光函，尤獻(xiàn)民*

(遼寧省中醫(yī)藥研究院，遼寧 沈陽 110034)

目的：初步探討刺玫根不同極性提取物的體外抗氧化活性。方法：采用分光光度法測定刺玫根不同極性提取物的總還原性，及其對DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子的清除作用。結(jié)果：建立了刺玫根不同極性提取物的總還原性曲線和DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子抑制曲線。結(jié)論：初步明確了刺玫根不同極性提取物的抗氧化能力，其萃取后的乙酸乙酯、正丁醇提取物抗氧化能力有所增強(qiáng)。

刺玫根；提取物；體外抗氧化活性

刺玫根為薔薇科植物山刺玫RosadavuricaPall.的根，又名刺葛薔薇根、野玫瑰根，廣泛分布于黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古、河北、山西等地，資源豐富。該藥具有止血及廣譜抗菌作用，可用于治療經(jīng)血不止、功能性子宮出血、腸炎、細(xì)菌性痢疾和腎炎等疾病[1]。本研究在水提取刺玫根后，用不同極性的有機(jī)溶劑萃取水提液[2]，得到刺玫根不同極性的有效成分，對其進(jìn)行體外抗氧化實驗，為研究刺玫根的抗氧化作用提供依據(jù)。

1 儀器與試劑

儀器：721型分光光度計(山東高密彩虹儀器有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞容生化儀器廠)，恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠)，KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

試劑：DPPH、2，6-二叔丁基對甲酚 (BHT)、抗壞血酸 (VC)、還原型輔酶I(NADH I)、氮藍(lán)四唑(NBT)、酚嗪硫酸甲酯(PMS)、沒食子酸、番紅均為sigma公司產(chǎn)品；鐵氰化鉀、三氯乙酸、FeCl3、EDTANa2、FeSO4·7H2O、H2O2均為分析純，購于沈陽試劑一廠。

2 方法與結(jié)果

2.1 不同極性供試品溶液制備

取藥材2kg，劈碎，浸泡半小時，加10倍量水提取2次，每次2h，濃縮至1g/mL藥液，取1 000mL提取液蒸干，得刺玫根水提物。剩余藥液加等量95%乙醇放置過夜，虹吸上清液，沉淀干燥得到刺玫根醇沉物。上清液回收乙醇至無醇味，加水至1 000mL，加入等量乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，回收乙酸乙酯至干，加入適量70%乙醇溶解，糊精拌樣，得到刺玫根乙酸乙酯提取物(1∶20)；萃取后水提液加入等量正丁醇，萃取4次，合并萃取液，回收正丁醇至干，加入適量70%乙醇溶解，糊精拌樣，得到刺玫根正丁醇提取物(1∶10)。將不同極性提取液分別配置成適當(dāng)濃度梯度系列溶液，備用。

2.2 不同提取物清除DPPH自由基測定[3-4]

DPPH是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，若提取物能將其清除，則表明該提取物能降低烷基自由基濃度，阻斷脂質(zhì)過氧化鏈反應(yīng)。分別取不同濃度供試液2mL，加入0.1mmol/DPPH溶液2mL，渦旋混勻后，室溫放置30min，于517nm波長下測定吸光度值，計算抑制率，計算公式為：(A對-A樣)/A對×100%。以VC為陽性對照，95%乙醇為空白，以95%乙醇代替藥液。以清除率為縱坐標(biāo)，以濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)作圖，所得清除曲線如圖1所示。相近濃度下乙酸乙酯層和正丁醇層的DPPH自由基清除能力均優(yōu)于陽性對照VC。

圖1 不同濃度提取物DPPH自由基清除曲線

2.3 不同提取物對超氧陰離子清除作用[5]

超氧陰離子自由基可將NBT還原為藍(lán)色物質(zhì)，其在560nm波長處有吸收。利用該原理，分別在試管中加入259μmol/L NADH I溶液0.9mL、163μmol/L NBT溶液0.9mL、52.8μmol/L PMS溶液0.3mL，后立即加入不同濃度樣品0.3mL，渦旋混勻后，室溫放置5min，于560nm波長下測定吸光度.(空白不加PMS，對照不加樣品)，計算抑制率,計算公式為(A對-A樣)/A對×100%。以沒食子酸為陽性對照，以清除率為縱坐標(biāo)，以濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)作圖，清除曲線如圖2所示。在相近濃度下，乙酸乙酯層和正丁醇層對超氧陰離子的清除能力均優(yōu)于陽性對照沒食子酸。

圖2 不同濃度提取物超氧陰離子自由基清除曲線

2.4 不同提取物抑制羥自由基作用[6-7]

在生命代謝過程產(chǎn)生的自由基中，OH·是最活潑的活性氧，氧化能力極強(qiáng)。本實驗采用Fenton法測定不同極性提取物溶液對羥自由基的抑制作用。本實驗的原理為H2O2與Fe2+作用產(chǎn)生羥自由基，可使番紅褪色，減小其在520nm下的吸光度。各管中分別加入0.02mol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液1.5mL、520μg/mL番紅300μL、2mmol/L EDTANa2-Fe2+200μL、不同濃度的樣品，最后加入6%H2O2200μL，混勻后40℃水浴40min，于517nm下測定吸光度(空白以蒸餾水代替藥液，對照以蒸餾水代替EDTANa2-Fe2+和藥液)，計算抑制率，計算公式為(A樣-A空)/(A對-A空)×100%。以VC為陽性對照，以清除率為縱坐標(biāo)，以濃度為橫坐標(biāo)作圖，清除曲線如圖3所示。正丁醇、水層、乙酸乙酯層對羥自由基的抑制作用均優(yōu)于陽性對照VC。

圖3 不同濃度提取物羥自由基清除曲線

2.5 不同提取物總還原性測定[8]

鐵氰化鉀被還原為亞鐵氰化鉀后，可與三氯化鐵作用，生成亞鐵氰化鐵，在700nm處可測定其吸光度，吸光度值越大，表明其還原性越強(qiáng)。取不同濃度供試液各1mL，分別與2.5mL磷酸緩沖液混合后，加入2.5mL 1%鐵氰化鉀，置于50℃水浴鍋中加熱20min，再加入1mL 10%三氯乙酸，混勻后取上清液2.5mL，加蒸餾水2.5mL和0.1% FeCl30.5mL，于700nm波長處測定吸光度。以VC為陽性對照，以吸光度為縱坐標(biāo)，以濃度為橫坐標(biāo)作圖，總還原曲線如圖4所示。在相近濃度下，正丁醇層的總還原性均優(yōu)于陽性VC，乙酸乙酯層總還原性與VC接近。

圖4 不同濃度提取物總還原性曲線

3 結(jié)論

山刺玫為薔薇科植物，廣泛分布于黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古、河北、山西等地，資源豐富，其根、花和果實均可入藥。目前對山刺玫的研究多集中在刺玫果上，對刺玫根的研究較少。本實驗首次對刺玫根及其不同極性提取物進(jìn)行了系統(tǒng)的抗氧化活性研究。

刺玫根不同極性提取物對自由基的清除作用均表現(xiàn)出一定的濃度依賴性，但在清除DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子試驗中，當(dāng)濃度升高到一定程度后，其清除率不再隨著濃度的增大而增大，而是進(jìn)入了一個平臺期。

本試驗中，根據(jù)極性的不同，采用不同溶劑萃取法，將刺玫根水提物劃分為不同極性有效部分，分別進(jìn)行抗氧化試驗。在清除DPPH自由基試驗中，其清除能力大小依次為乙酸乙酯層、正丁醇層、醇沉層、水層；在清除超氧陰離子試驗中，其清除能力大小依次為正丁醇層、乙酸乙酯層、醇沉層、水層；在抑制羥自由基試驗中，其抑制能力大小依次為正丁醇層、水層、乙酸乙酯層、醇沉層；在總還原性試驗中，其還原能力大小依次為正丁醇層、乙酸乙酯層、水層、醇沉層。在不同的抗氧化試驗中，不同提取物的抗氧化能力大小有所差異，造成該現(xiàn)象的原因可能是萃取法只是根據(jù)極性對刺枚根中的有效成分進(jìn)行大致分類，每一層中仍含有多種有效成分。進(jìn)行不同抗氧化活性實驗時，每種成分發(fā)揮的作用大小不同，所以累積起來表現(xiàn)出的綜合效果也有所不同。但總體來說，經(jīng)過萃取后，正丁醇層和乙酸乙酯層提取物的抗氧化能力均有較大提高，甚至超過了陽性對照品。該實驗為刺玫根中抗氧化活性物質(zhì)的進(jìn)一步提取分離指明了方向。

[1] 謝曉燕,貢濟(jì)宇,王立巖.山刺玫根的生藥學(xué)研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2007,18(9):2112-2113.

[2] 徐正斌,郭秀芳,史久良.刺玫根治療慢性氣管炎有效部位的探討[J].黑龍江醫(yī)藥,1983(3):51-52.

[3] 師梅梅,楊建雄.龍血竭膠囊的體外抗氧化研究[J].中成藥,2007,29(11):1591-1594.

[4] 王輝,孫春艷,劉剛.異心蓮的體外抗氧化活性[J].中國生化藥物雜志,2005,26(1):21-23.

[5] 管福琴,劉敏,單宇,等.灰氈毛忍冬中五環(huán)三萜類化合物的抗氧化活性研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2013,24(6):1315-1317.

[6] 莫正昌,鄧 靖,汲廣全,等.鹿蹄草提取物體外抗氧化活性評價[J].食品科學(xué),2010,31(3):19-20.

[7] 崔月花,章克昌.靈芝三萜皂苷( GCTL1) 的體外抗氧化作用[J].食品科學(xué),2010,31(19): 49-51.

[8] 謝廣發(fā),朱成鋼,胡志明,等.黃酒的體外抗氧化及其機(jī)理研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2005,31(10):5-9.

(責(zé)任編輯：尹晨茹)

Study on Anti-oxidation Activity in Vitro ofRosadavuricaPall.Extracts

Liu Jing,Di Zizhen,Wang Guanghan,You Xianmin*

(Liaoning Traditional Chinese Medicine Institute, Shenyang 110034,China)

Objective:Discuss the anti-oxidation effects in vitro ofRosadavuricaPall. extracts. Methods:The anti-oxidation effects ofRosadavuricaPall. extracts were determined by The UV spectrophotometry. the anti-oxidation effects in vitro were analyzed by different assay such as total reducing power,DPPH radical scavenging assay,hydroxyl radical scavenging assay and superoxide radical scavenging assay. Results:Obtained the curve of total reducing power,DPPH radical,hydroxyl radical and superoxide radical scavenging respectively. Conclusion:Initially clear the anti-oxidation activity in vitro ofRosadavuricaPall. The Anti-oxidation Activity in Vitro of Ethyl acetate and Butanol Extracts were strengthened.

RosadavuricaPall.;Extracts;Anti-oxidation Effects in Vitro

2014-02-17

國家“十二五”重大新藥創(chuàng)制項目(2012ZX09303-017)

劉晶(1980-)，女，碩士，遼寧省中醫(yī)藥研究院助理研究員，研究方向為中藥新藥開發(fā)。

尤獻(xiàn)民(1964-)，男，遼寧省中醫(yī)藥研究院研究員，研究方向為中藥質(zhì)量控制。E-mail：18940158727@126.com。

R285.5

A

1673-2197(2014)10-0030-02