清胃黃連丸對急性胸膜炎大鼠抗炎作用探析

吳 君，韓 蕓，李寶紅

(1.山東中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，山東 煙臺 264199；2.濱州醫(yī)學(xué)院，山東煙臺 264003；3.廣東醫(yī)學(xué)院，廣東 東莞 523808)

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清胃黃連丸對急性胸膜炎大鼠抗炎作用探析

吳 君1，韓 蕓2，李寶紅3*

(1.山東中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，山東 煙臺 264199；2.濱州醫(yī)學(xué)院，山東煙臺 264003；3.廣東醫(yī)學(xué)院，廣東 東莞 523808)

目的：考察清胃黃連丸對角叉菜膠誘導(dǎo)的大鼠胸膜炎的影響。方法：采用大鼠胸腔注射0.2mL 1%角叉菜膠誘導(dǎo)胸膜炎模型，根據(jù)胸腔滲出液體積、滲出液中白細(xì)胞計(jì)數(shù)、PGE2含量、TNF-α含量評價(jià)清胃黃連丸抗急性炎癥的作用。結(jié)果：清胃黃連丸可顯著降低急性胸膜炎大鼠滲出液體積及滲出液中白細(xì)胞總數(shù)、PGE2含量、TNF-α含量。結(jié)論：清胃黃連丸對角叉菜膠所致急性胸膜炎大鼠有明顯的保護(hù)作用，作用機(jī)制可能與降低PGE2、TNF-α的含量有關(guān)。

清胃黃連丸；角叉菜膠；急性胸膜炎；PGE2； TNF-α

清胃黃連丸是中國藥典(2010版)收載的中成藥，由黃連、石膏、桔梗、甘草、知母、玄參、地黃、牡丹皮、天花粉、連翹、梔子、黃柏、黃芪和赤芍十四味中藥組成，具有清胃瀉火、解毒消腫之效，臨床上主要用于治療口舌生瘡、咽喉腫痛等[1]。前期藥效學(xué)研究發(fā)現(xiàn)清胃黃連丸有較好的抗炎作用[2]，本文進(jìn)一步研究清胃黃連丸對急性炎癥的作用，以期為臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品及試劑

清胃黃連丸(北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠)，阿司匹林(印尼拜耳公司，德國拜耳藥廠監(jiān)制)，角叉菜膠(Sigma公司)，腫瘤壞死因子-α試劑盒(上海卓康公司產(chǎn)品)，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

恒溫水浴箱：成都泰盟醫(yī)療設(shè)備有限公司；電子天平：常熟市雙杰測試儀器廠，T1000；RT-2100C酶標(biāo)儀；XYJ-801型電動離心機(jī)：江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；可調(diào)式移液槍；紫外可見分光光度計(jì)；OLYMPUS-IX51倒置顯微鏡。

1.3 動物

SPF級大鼠，雄性，60只，體重200～220g，購于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號：SCXK(粵)2008-0020。

2 方法

2.1 動物分組、給藥與致炎[3]

取200～220g SPF級大鼠60只，按體重隨機(jī)分為6組，每組10只，即：正常組、模型組、阿司匹林組、清胃黃連丸低、中、高劑量組。按照表1中劑量連續(xù)灌胃給藥6d，給藥量均為10mL/kg。正常組和模型組給予等體積蒸餾水。于末次給藥后30min，乙醚輕度麻醉，除正常組外，各組大鼠均向右胸腔內(nèi)注射1%角叉菜膠0.2mL，正常組注入等量生理鹽水。致炎8h后將大鼠處死，用剪刀將右側(cè)胸壁肋軟骨處剪開一小口，可從該口到達(dá)胸腔。用微量移液器將胸腔內(nèi)全部滲出液吸出并計(jì)量，再用冰生理鹽水沖洗胸腔，沖洗液與滲出液合并，至離心管內(nèi)(冰浴)，3 000r/min離心10min，取上清液待測。

2.2 指標(biāo)檢測

2.2.1 大鼠胸腔內(nèi)滲出液計(jì)量和白細(xì)胞計(jì)數(shù) 用移液槍將胸腔內(nèi)全部滲出液吸出并計(jì)量，吸取10μL原滲液用1%鹽酸水溶液作為稀釋液，在顯微鏡下用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)[4]。

2.2.2 胸腔滲出液中前列腺素E2(PGE2)含量測定 取胸腔滲液上清液150μL，加0.5mol·L-1KOH-甲醇溶液1mL，50℃水浴異構(gòu)化20min后，用甲醇稀釋至4mL，紫外分光光度計(jì)在波長278nm處測定其吸光度(OD)值，代表PGE2的生成量[5]。

2.2.3 胸腔滲出液中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量測定 將待測樣品和配置好各濃度標(biāo)準(zhǔn)品100μL加入到預(yù)先已用抗大鼠TNF-α單克隆抗體包被的酶標(biāo)板上：將反應(yīng)板充分混勻后置37℃溫箱90min，使標(biāo)準(zhǔn)品、待測樣品中的抗原與單抗充分結(jié)合；洗板：用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4次，在濾紙上印干；每孔(除空白孔外)中加入生物素化的一抗工作液100μL，置37℃溫箱60min；洗板；每孔(除空白孔外)加辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素抗體工作液100μL，將反應(yīng)板置37℃溫箱60min，使酶標(biāo)抗體工作液與生物素化一抗結(jié)合成復(fù)合物；洗板；每孔加入顯色劑100μL，置37℃暗處反應(yīng)10min；每孔加入100μL終止液混勻；在酶標(biāo)儀上450nm處測各孔吸光值。將所有OD值減除空白值后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，該曲線圖上查出每1mL組織勻漿中TNF-α的含量。

2.3 統(tǒng)計(jì)方法

3 結(jié)果

3.1 清胃黃連丸對急性胸膜炎大鼠胸腔滲出液和白細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響

與正常組相比，模型組大鼠胸腔注射角叉菜膠后出現(xiàn)明顯滲出液體積和白細(xì)胞總數(shù)顯著升高(P<0.01)，呈急性炎癥表現(xiàn)，說明大鼠胸膜炎造模成功。與模型組相比，阿司匹林組、清胃黃連丸各劑量組可顯著抑制胸膜炎大鼠炎性液的滲出及白細(xì)胞總數(shù)升高(P<0.01或P<0.05)。詳見表1。

表1 清胃黃連丸對急性胸膜炎大鼠胸腔

注：與模型組比較，1)P<0.05，2)P<0.01。

3.2 清胃黃連丸對急性胸膜炎大鼠胸腔滲出液中PGE2含量的影響

與正常組相比，急性胸膜炎大鼠滲出液中PGE2含量顯著升高(P<0.01)，阿司匹林組、清胃黃連丸各劑量組可顯著降低滲出液中炎癥介質(zhì)PGE2含量(P<0.01或P<0.05)。詳見表2。

表2 清胃黃連丸對急性胸膜炎大鼠胸腔

滲出液中PGE2含量的影響

組別劑量(g·kg-1)PGE2含量(OD)正常組-0.247±0.0222)模型組-0.642±0.075清胃黃連丸1.50.423±0.0471)30.355±0.0232)60.292±0.0332)阿司匹林0.20.327±0.0312)

注：與模型組比較，1)P<0.05，2)P<0.01。

3.3 清胃黃連丸對急性胸膜炎大鼠胸腔滲出液中TNF-α含量的影響

與正常組相比，急性胸膜炎大鼠滲出液中TNF-α含量顯著升高(P<0.01)，與模型組相比，阿司匹林組、清胃黃連丸各劑量組可顯著降低滲出液中TNF-α含量(P<0.01或P<0.05)。詳見表3。

表3 清胃黃連丸對急性胸膜炎大鼠

胸腔滲出液中TNF-α含量的影響

組別劑量((g·kg-1)TNF-α含量(ng·mL-1)正常組-0.559±0.0762)模型組-1.352±0.196清胃黃連丸1.50.968±0.1511)30.881±0.1422)60.818±0.2322)阿司匹林0.20.938±0.1682)

注：與模型組比較，1)P<0.05，2)P<0.01。

4 討論

角叉菜膠誘導(dǎo)的大鼠胸膜炎模型是以炎性滲出和白細(xì)胞游走為主要改變的急性炎癥模型。炎性刺激可引起大量血漿蛋白質(zhì)(如酶類和炎性介質(zhì)等)的分泌，導(dǎo)致炎性滲出液中蛋白含量大大增加。故大鼠胸膜炎炎性滲出液量、滲液中的白細(xì)胞游走數(shù)可作為衡量炎癥的重要指標(biāo)。

PGE2由環(huán)氧合酶(COX)催化花生四烯酸合成，COX存在兩種異構(gòu)體，即COX-1及COX-2。COX-l是結(jié)構(gòu)酶，在正常生理情況下具有活性，催化生成的PGE2具有多種重要生理功能；COX-2是誘導(dǎo)酶，生理狀況下活性很低，當(dāng)受到某些因子刺激后，在炎癥細(xì)胞中高表達(dá)，水平急劇增加，進(jìn)而引起炎癥部位PGE2等產(chǎn)物大量增加,促進(jìn)炎癥反應(yīng)及組織損傷[6]。本實(shí)驗(yàn)中清胃黃連丸可減少大鼠胸膜炎滲出液中PGE2含量，提示其抗炎作用可能與其抑制COX-2的活性，進(jìn)而阻斷炎性介質(zhì)PGs的合成與釋放有關(guān)。

TNF-α是一種由活化的單核-巨噬細(xì)胞分泌的促炎癥因子，是導(dǎo)致炎性介質(zhì)級聯(lián)反應(yīng)的始發(fā)因子。其可通過多種生物學(xué)途徑誘發(fā)或激活體內(nèi)產(chǎn)生多種炎癥介質(zhì)，它們又相互作用，相互影響，加重組織的損傷和炎癥[7]。本實(shí)驗(yàn)中清胃黃連丸可顯著抑制炎癥時細(xì)胞因子TNF-α的大量產(chǎn)生，從而達(dá)到抗炎的效果。細(xì)胞因子之間的作用是復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，還有許多細(xì)胞因子在炎癥中發(fā)揮重要的作用。如IL-2、IL-8、IL-10、IL-19等都在炎癥發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮或拮抗或促進(jìn)作用。清胃黃連丸對這些因子是否有影響，還有待進(jìn)一步研究。

[1] 國家藥典委員會.中國藥典[M].一部.北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:444.

[2] 李寶紅,吳君,鄧妙麗,等.清胃黃連丸抗炎作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].西北藥學(xué)雜志,2011,26(3):192-193.

[3] 徐叔云,卞如濂,陳修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].第2版.北京:人民衛(wèi)生出版社,1994:714.

[4] 李東曉,陳東輝,羅霞,等.鹿角菜膠所致小鼠胸膜炎模型[J].中藥藥理與臨床,2000,16(5):46-47.

[5] 陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1993:370-371.

[6] 唐秀能,黃建春,賀敏,等.月光花豆乙醇提取物對大鼠急性胸膜炎的作用及其機(jī)制的研究[J].北京中醫(yī)藥,2009,28(8):641-643.

[7] 吳洪福，耿排力.炎癥細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)與疾病[J].青海醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2003,24(4):267.

(責(zé)任編輯：魏 曉)

Anti-inflammatory Effects of Qingwei Huanglian Pill on Rats With Acute Pleurisy

Wu Jun1, Han yun2，Li Baohong3*

(1.Shan Dong College of Traditional Chinese Medicine，Yantai 264199,China；2.Binzhoiu Medical University Yantai 264003,China; 3. Pharmaceutical School of Guangdong Medical College，Dongguan 523808,China)

Objective:Studying effects of Qing wei Huanglian Pill on rats pleurisy induced by carrageenan. Methods:Pleurisy model was induced by injection of carrageenan 0.2mL1% into rat pleural.The anti-acute inflammation effects of Qingwei Huanglian Pill was evaluated by detection of pleural effusion volume，exudate leukocyte count，the contents of TNF-α and PGE2.Results:Qingwei Huanglian Pill significantly reduces the pleural effusion volume of rats with acute pleurisy，the white blood cell count of exudates and the contents of TNF-α and PGE2.Conclusion:Qingwei Huanglian Pill have a significant protective effect on rats with acute pleurisy induced by carrageenan.Mechanism of action may be related to lower levels of PGE2, TNF-α.

Qingwei Huanglian Pill；Carrageenateacute Pleurisy；PGE2；TNF-α

2014-05-04

吳君(1981-)，男，山東中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校講師，研究方向?yàn)橹兴帍?fù)方藥理學(xué)。

李寶紅(1968-)，男，廣東醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院副研究員，研究方向?yàn)樗幬镙d體與控制釋放。

R561.1

A

1673-2197(2014)17-0008-02