三種抑菌劑對(duì)蛋白核小球藻生物量和脂質(zhì)含量的影響

王存文，孟 陽，汪鐵林，呂仁亮＊，王成成，張艷芳

［1．武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，湖北 武漢 430074；2．綠色化工過程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（武漢工程大學(xué)），湖北 武漢 430074］

0 引 言

生物柴油作為一種可再生的環(huán)保能源，在過去幾十年里引起了全世界的廣泛關(guān)注［1］．植物油、動(dòng)物脂肪和微生物油脂是生產(chǎn)生物柴油的主要原料［2－3］．其中，微生物油脂的脂質(zhì)產(chǎn)量高，而且與傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)相比，微生物細(xì)胞增殖快、生產(chǎn)周期短、生產(chǎn)成本低、生長(zhǎng)所需的原料來源廣泛［4］．在眾多的微生物中，微藻的油脂成分較為單一、組成與普通植物油相似，且產(chǎn)率較高（在特定培養(yǎng)條件下可達(dá)到自身干重質(zhì)量分?jǐn)?shù)的85%）［5］．微藻適應(yīng)環(huán)境的能力很強(qiáng)，在整個(gè)生物圈均有分布，不會(huì)與農(nóng)作物爭(zhēng)搶良田［6］．微藻具有較高的光合效率，可以提供更有效的方法來回收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)［7］，其代謝產(chǎn)物量比傳統(tǒng)微生物要高得多［8］．用葡萄糖異養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)微藻可達(dá)到51．2 g／L的生物量［9］，而富油微藻能夠產(chǎn)生大量的單細(xì)胞油脂（SCOs），產(chǎn)量可超過其干重質(zhì)量分?jǐn)?shù)的20%［10］，這些單細(xì)胞油脂的主要成分是非常適合于生產(chǎn)生物柴油的甘油三酯（TAGs）［11］．其中，蛋白核小球藻因繁殖能力強(qiáng)、用途廣泛而受到廣泛的關(guān)注，本研究選取蛋白核小球藻作為研究對(duì)象．

微藻在培養(yǎng)過程中通常會(huì)受到其他微生物的污染．這些微生物會(huì)對(duì)其生長(zhǎng)速度及藻密度產(chǎn)生影響，其中細(xì)菌的影響較為顯著．可與微藻共同生存的細(xì)菌被稱為共生菌，存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系的則被稱為非共生菌［12］．非共生菌對(duì)微藻的生長(zhǎng)是有害的，甚至有些具有溶藻性的細(xì)菌對(duì)微藻來說是致命的［13］．抑菌劑對(duì)于細(xì)菌具有良好的抑制作用，采用抑菌劑可消除非共生菌對(duì)微藻生長(zhǎng)的影響［14］．關(guān)于抑菌劑在微藻培養(yǎng)中的應(yīng)用的報(bào)道主要集中在藻類遺傳轉(zhuǎn)化中的選擇性標(biāo)記［15］．微藻在培養(yǎng)過程中通常會(huì)受到放線菌和霉菌的污染．孟加拉紅、制霉菌素和硫酸鏈霉素能夠有效抑制放線菌和霉菌的繁殖線菌［16－17］．據(jù)筆者所知，至今未見孟加拉紅對(duì)小球藻生長(zhǎng)影響的報(bào)道．

本實(shí)驗(yàn)選用孟加拉紅、制霉菌素和硫酸鏈霉素作為抑菌劑，研究其對(duì)蛋白核小球藻生長(zhǎng)的影響，旨在尋找可抑制或消滅微藻非共生菌而對(duì)微藻本身影響較小或有促進(jìn)作用的抑菌劑．

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 材料

孟加拉紅（生物純級(jí)）購(gòu)自阿拉丁試劑，硫酸鏈霉素［Amresco 0382，Potency（dry basis）：650～850 mcg／mg］和制霉菌素［Amresc 0418，Potency（anhydrous）：4 400 u／mg］購(gòu)自武漢華順生物技術(shù)有限公司．BG－11培養(yǎng)基根據(jù)文獻(xiàn)［18］配置，所用試劑全部為分析純級(jí)．蛋白核小球藻購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院武漢水生生物研究所．

1．2 微藻培養(yǎng)

培養(yǎng)溫度為25℃，將微藻置于100 m L錐形瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為BG－11培養(yǎng)基，并用強(qiáng)度為4 000 lx的冷白光燈對(duì)微藻進(jìn)行光照，光暗周期L∶D＝12 h∶12 h．同時(shí)每天搖動(dòng)培養(yǎng)瓶數(shù)次，以防止微藻下沉或附壁．在實(shí)驗(yàn)組中加入抑菌劑，依文獻(xiàn)選取3種抑菌劑的質(zhì)量濃度分別為：孟加拉紅23 mg／L、硫酸鏈霉素30 mg／L和制霉菌素25 mg／L［19－21］．每個(gè)實(shí)驗(yàn)都包括實(shí)驗(yàn)組和不加抑菌劑的對(duì)照組，兩組的其它培養(yǎng)條件相同．

1．3 微藻細(xì)胞密度分析

微藻細(xì)胞密度采用紫外分光光度計(jì)（天津拓普WFZ－26A）和托馬血細(xì)胞計(jì)數(shù)器（上海求精生化試劑儀器有限公司，滬制02270113號(hào)）測(cè)定．利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定蛋白核小球藻在680 nm處的吸光度，并用托馬血細(xì)胞計(jì)數(shù)器測(cè)得細(xì)胞數(shù)，可得到細(xì)胞數(shù)和吸光度的關(guān)系曲線［22］．經(jīng)測(cè)試，孟加拉紅、制霉菌素和硫酸鏈霉素在680 nm下均無吸收．本實(shí)驗(yàn)測(cè)得蛋白核小球藻的藻密度與吸光度之間的關(guān)系如圖1所示．實(shí)驗(yàn)過程中測(cè)定樣品在680 nm處的吸光度即可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到微藻的細(xì)胞密度．

圖1 微藻細(xì)胞密度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig．1 The standard curve of algal cell density

2 結(jié)果與討論

2．1 單一抑菌劑的影響

2．1．1 孟加拉紅的影響 孟加拉紅對(duì)蛋白核小球藻生長(zhǎng)情況的影響如圖2所示．在初始24 h內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組的微藻密度略有下降，由1．229×107cells／mL減少至1．172×107cells／m L．微藻對(duì)孟加拉紅有一個(gè)適應(yīng)的過程，從而導(dǎo)致在培養(yǎng)初期藻密度會(huì)有所降低．隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，微藻逐漸適應(yīng)孟加拉紅，藻密度逐漸增加．培養(yǎng)96 h后，藻密度增加至1．790×107cells／m L．隨后藻密度急劇增加，培養(yǎng)時(shí)間為120 h時(shí)增加至2．264×107cells／mL，到168 h，達(dá)到4．216×107cells／m L，而不經(jīng)處理的對(duì)照組小球藻細(xì)胞密度僅為3．325×107cells／mL．這是因?yàn)榈蜐舛鹊幕钚匝蹩杉せ畹鞍酌福{(diào)節(jié)基因表達(dá)的合成和誘導(dǎo)，導(dǎo)致細(xì)胞增殖［23－24］，可出現(xiàn)毒物興奮效應(yīng)［25］，即低含量的毒性介質(zhì)所產(chǎn)生的刺激作用促使微藻生長(zhǎng)率顯著增加．隨著毒性介質(zhì)濃度的降低，微藻細(xì)胞的生長(zhǎng)得到恢復(fù)和促進(jìn)．結(jié)果表明，較低濃度的孟加拉紅能夠明顯促進(jìn)蛋白核小球藻的生長(zhǎng)，提高藻密度．

圖2 加入孟加拉紅后小球藻的生長(zhǎng)曲線Fig．2 Growth curve of Chlorella pyrenoidosa after exposure to Rose Bengal

2．1．2 制霉菌素的影響 如圖3所示，在加入了制霉菌素的實(shí)驗(yàn)組中，藻密度隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)而降低，從1．192×107cells／mL下降至5．23×106cells／m L．微藻的顏色也從綠色轉(zhuǎn)變?yōu)樽攸S色．一定濃度的制霉菌素對(duì)蛋白核小球藻具有毒害作用，會(huì)導(dǎo)致大量藻細(xì)胞死亡，從而導(dǎo)致藻密度降低、藻細(xì)胞顏色改變，抑制蛋白核小球藻的生長(zhǎng)［26］．雖沒有直接的證據(jù)證明制霉菌素影響小球藻的代謝過程，但可能因?yàn)橹泼咕匚誎＋，導(dǎo)致輔因子從細(xì)胞中滲漏，最終導(dǎo)致代謝停止［27］．制霉菌素對(duì)蛋白核小球藻的生長(zhǎng)具有非常明顯的抑制作用．

圖3 加入制霉菌素后小球藻的生長(zhǎng)曲線Fig．3 Growth curve of Chlorella pyrenoidosa after exposure to Nystatin

2．1．3 硫酸鏈霉素的影響 如圖4所示，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中蛋白核小球藻的生長(zhǎng)趨勢(shì)基本相同，但實(shí)驗(yàn)組的藻密度始終高于對(duì)照組，藻密度的最大值分別為3．512×107cells／m L和3．325×107cells／m L．培養(yǎng)120 h后，兩組微藻都進(jìn)入穩(wěn)定期，對(duì)照組的藻密度保持穩(wěn)定，而實(shí)驗(yàn)組的藻密度則略有下降．144 h后兩組的藻密度趨于相等．在培養(yǎng)初期，實(shí)驗(yàn)組中的蛋白核小球藻的生長(zhǎng)速率比對(duì)照組要高得多．這主要是因?yàn)榱蛩徭溍顾貙?duì)微藻生長(zhǎng)產(chǎn)生促進(jìn)作用，在微藻進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期后，硫酸鏈霉素的濃度降低，促進(jìn)生長(zhǎng)的作用減弱．

圖4 加入硫酸鏈霉素后小球藻的生長(zhǎng)曲線Fig．4 Growth curve of Chlorella pyrenoidosa after exposure to Streptomycin Sulphate

2．2 混合抑菌劑的影響

單一抑菌劑孟加拉紅和硫酸鏈霉素均對(duì)微藻生長(zhǎng)具有一定的促進(jìn)作用，但在蛋白核小球藻的不同培養(yǎng)階段產(chǎn)生的效果不同．本實(shí)驗(yàn)將這兩種抑菌劑配合使用，研究了混合抑菌劑對(duì)蛋白核小球藻生長(zhǎng)的影響．抑菌劑采用以下3種方式加入：A．實(shí)驗(yàn)初期同時(shí)加入兩種抑菌劑；B．實(shí)驗(yàn)初期加入孟加拉紅，96 h后加入硫酸鏈霉素；C．實(shí)驗(yàn)初期加入硫酸鏈霉素，96 h后加入孟加拉紅．

如圖5所示，按3種方式加入抑菌劑后，小球藻的生長(zhǎng)均受到程度不一的抑制，嚴(yán)重的甚至導(dǎo)致死亡．可見混合抑菌劑比單一抑菌劑對(duì)蛋白核小球藻的毒性作用更大，且由于抑菌劑擁有各自的抗菌譜圖，當(dāng)將抑菌劑進(jìn)行混合后，它們對(duì)微藻的影響也更為復(fù)雜［19，21，28］．藻的細(xì)胞膜可能會(huì)被破壞，最終導(dǎo)致代謝停止．

2．3 抑菌劑對(duì)脂質(zhì)含量的影響

本實(shí)驗(yàn)利用超臨界CO2萃取法和索氏提取法對(duì)實(shí)驗(yàn)組（在培養(yǎng)基中加入單一的孟加拉紅或硫酸鏈霉素）和對(duì)照組的微藻進(jìn)行脂質(zhì)含量測(cè)定．超臨界CO2萃取法的實(shí)驗(yàn)條件為：萃取溫度45℃，壓力30 MPa，萃取時(shí)間120 min［29］；索氏提取法采用無水乙醚作為提取劑，每小時(shí)虹吸6次，持續(xù)12 h，提取劑提取藻粉時(shí)已經(jīng)無色可視為提取完全［30］．

圖5 不同的抑菌劑混合方式對(duì)微藻生長(zhǎng)的影響Fig．5 The effect of mixed antibiotics on microalgae

表1列出了經(jīng)超臨界CO2萃取法和索氏提取法得出的微藻油脂含量，油脂含量用藻細(xì)胞干重的百分?jǐn)?shù)表示．由表1可知，無論是否經(jīng)孟加拉紅或硫酸鏈霉素處理，微藻的脂質(zhì)含量幾乎沒有受到影響．與對(duì)照組相比，在加入孟加拉紅和硫酸鏈霉素后，雖然小球藻的脂質(zhì)含量都略有下降但變化不大，對(duì)這兩種油脂提取方法而言，孟加拉紅實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組的油脂含量均下降了0．5%，下降幅度分別為2．12%和2．18%；硫酸鏈霉素實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組的油脂含量分別下降了0．1%和0．8%，下降幅度分別為0．42%和3．49%．

表1 微藻細(xì)胞內(nèi)油脂含量Table 1 The lipid content of microalgae

3 結(jié) 語

本實(shí)驗(yàn)研究了孟加拉紅，制霉菌素和硫酸鏈霉素對(duì)蛋白核小球藻生長(zhǎng)情況的影響，并利用超臨界CO2萃取法和索氏提取法從微藻中提取了油脂．結(jié)果表明，單獨(dú)加入孟加拉紅或硫酸鏈霉素對(duì)蛋白核小球藻的脂質(zhì)含量幾乎沒有影響，其藻密度的最大值分別可達(dá)到4．216×107cells／m L、3．512×107cells／m L，高于對(duì)照組的 3．325×107cells／m L．制霉菌素會(huì)抑制蛋白核小球藻的生長(zhǎng)，孟加拉紅和硫酸鏈霉素可以促進(jìn)微藻的生長(zhǎng)，但孟加拉紅和硫酸鏈霉素的混合物對(duì)微藻生長(zhǎng)有抑制作用．

致謝

感謝綠色化工過程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室及武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院提供的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)！

［1］VASUDEVAN P T，BRIGGS M．Biodiesel productioncurrent state of the art and challenges［J］．Journal of Industrial Microbiology ＆ Biotechnology，2008，35（5）：421－430．

［2］HIMMEL M E，DING S Y，JOHNSON D K，et al．Biomass recalcitrance：engineering plants and enzymes for biofuels production［J］．Science，2007，315（5813）：804－807．

［3］MATA T M，MARTINS A A，CAETANO N S．Microalgae for biodiesel production and other applications：a review［J］．Renewable and Sustainable Energy Reviews，2010，14（1）：217－232．

［4］PRíOS S D，TORRES C M，TORRAS C，et al．Microalgae－based biodiesel：economic analysis of downstream process realistic scenarios［J］．Bioresource Technology，2013，136：617－625．

［5］MENG X，YANG J，XU X，et al．Biodiesel production from oleaginous microorganisms［J］．Renewable Energy，2009，34（1）：1－5．

［6］AMARO H M，GUEDES A C，MALCATA F X．Antimicrobial activities of microalgae：an invited review［J］．Science Against Microbial Pathogens：Communicating Current Research and Technological Advances，2011（3）：1272－1284．

［7］DEBOER K，MOHEIMANI N R，BOROWITZKA M A，et al．Extraction and conversion pathways for microalgae to biodiesel：a review focused on energy consumption［J］．Journal of Applied Phycology，2012，24（6）：1681－1699．

［8］OLAIZOLA M．Commercial development of microalgal biotechnology：from the test tube to the marketplace［J］．Biomolecular Engineering，2003，20（4）：459－466．

［9］XIONG W，LI X，XIANG J，et al．High－density fermentation of microalga Chlorella protothecoides in bioreactor for microbio－diesel production［J］．Applied Microbiology and Biotechnology，2008，78（1）：29－36．

［10］PRUVOST J，VAN VOOREN G，LE GOUIC B，et al．Systematic investigation of biomass and lipid productivity by microalgae in photobioreactors for biodiesel application［J］．Bioresource Technology，2011，102（1）：150－158．

［11］KOSA M，RAGAUSKAS A J．Lipids from heterotrophic microbes：advances in metabolism research［J］．Trends in Biotechnology，2011，29（2）：53－61．

［12］CROFT M T，LAWRENCE A D，RAUX－DEERY E，et al．Algae acquire vitamin B12 through a symbiotic relationship with bacteria［J］．Nature，2005，438（7064）：90－93．

［13］傅麗君，安新麗，鄭天凌．環(huán)境中放線菌及其抑藻活性物質(zhì)研究的若干進(jìn)展［J］．地球科學(xué)進(jìn)展，2010（9）：960－965．FU Li－jun，AN Xin－li，ZHENG Tian－ling．Advances in algicidal substances produced by algae－lysing actinomycetes ［J］．Advances in Earth Science，2010（9）：960－965．（in Chinese）

［14］COTTRELL M T，SUTTLE C A．Production of axenic cultures of micromonas pusilla（prasinophyceae）using antibiotic 1［J］．Journal of Phycology，1993，29（3）：385－387．

［15］WALKER T L，COLLET C，PURTON S．Algal transgenics in the genomic era［J］．Journal of Phycology，2005，41（6）：1077－1093．

［16］司美茹，薛泉宏，來航線．放線菌分離培養(yǎng)基篩選及雜菌抑制方法研究［J］．微生物學(xué)通報(bào)，2004，31（2）：61－65．SI Mei－ru，XUE Quan－h(huán)ong，LAI Hang－xian．Studies on selection of the isolation medium for actinomycetes and inhabiti on methods to miscellaneousmicroorganism［J］．Microbiology，2004，31（2）：61－65．（in Chinese）

［17］沈萍，范秀容，李廣武．微生物學(xué)實(shí)驗(yàn) ［M］．3版．北京：高等教育出版社，1999．SHEN Ping，F(xiàn)AN Xiu－rong，LI Guang－wu．Experiment of microbiology［M］．3rd ed．Beijing：Higher Education Press，1999．（in Chinese）

［18］STANIER R，KUNISAWA R，MANDEL M，et al．Purification and properties of unicellular blue－green algae（order Chroococcales）［J］．Bacteriological Reviews，1971，35（2）：171－205．

［19］黃健，宮相忠，唐學(xué)璽，等．鏈霉素對(duì)海洋微藻的毒物刺激效應(yīng)［J］．青島海洋大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2000，30（4）：642－644．HUANG Jian，GONG Xiang－zhong，TANG Xue－xi，et al．Hormesis of streptomycin on 6 species of marine microalgae［J］．Journal of Ocean University of Qingdao，2000，30（4）：642－644．（in Chinese）

［20］趙培，王雪青，朱潮峰，等．3種常用抗生素應(yīng)用于海洋微藻無菌化培養(yǎng)的研究［J］．天津師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2007，27（2）：27－30．ZHAO Pei，WANG Xue－qing，ZHU Chao－feng，et al．Study of three commonly antibiotics in the axenic culture of marine－microalgae［J］．Journal of Tianjin Normal University：Natural Science Edition，2007，27（2）：27－30．（in Chinese）

［21］劉衛(wèi)東，蘇浩，虞星炬．培養(yǎng)基瓊脂濃度及抗生素對(duì)3種海洋微藻生長(zhǎng)的影響［J］．生物技術(shù)，2007，16（6）：75－77．LIU Wei－dong，SU Hao，YU Xing－ju．Effects of agar concentration and antibiotics on the growth of three marine microalgae［J］．Biology Technology，2007，16（6）：75－77．（in Chinese）

［22］沈萍萍，王朝暉，齊雨藻，等．光密度法測(cè)定微藻生物量［J］．暨南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)與醫(yī)學(xué)版，2001，22（3）：115－119．SHEN Ping－ping，WANG Zhao－h(huán)ui，QI Yu－zao，et al．An opticaldensity method for determination of micro algal biomass［J］．Journal of Jinan University：Natural Science，2001，22（3）：115－119．（in Chinese）

［23］DYPBUKT J M，ANKARCRONA M，BURKITT M，et al．Different prooxidant levels stimulate growth，trigger apoptosis，or produce necrosis of insulin－secreting RINm5F cells．The role of intracellular polyamines［J］．The Journal of Biological Chemistry，1994，269（48）：30553－30560．

［24］SCHRECK R，RIEBER P，BAEUERLE P A．Reactive oxygen intermediates as apparently widely used messengers in the activation of the NF－kappa B transcription factor and HIV－1［J］．The EMBO Journal，1991，10（8）：2247．

［25］STEBBING A R D．Hormesis－the stimulation of growth by low levels of inhibitors［J］．The Science of the Total Environment，1982，22：213－234．

［26］ROBINSON A．The effect of anti－fungal antibiotics on the nodulation of Trifolium subterraneum and the estimation of Rhizobium trifolii populations［J］．Animal Production Science，1968，8（32）：327－331．

［27］DONG Z Z，DONG Z F，DING D W．A method of quick determination of algal biomass［J］．Marine Sciences，2004，28（11）：1－2．

［28］黃健，唐學(xué)璽，宮相忠，等．低濃度毒物對(duì)海洋微藻生長(zhǎng)刺激效應(yīng)的初步研究［J］．應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2002，13（11）：1516－1518．HUANG Jian，TANG Xue－xi，GONG Xiang－zhong，et al．Preliminary study on the growth stimulation of marine microalgae stimulated by low level of toxicant［J］．Chinese Journal of Applied Ecology，2002，13（11）：1516－1518．（in Chinese）

［29］MENDES R L，COELHO J P，F(xiàn)ERNANDES H L，et al．Applications of supercritical CO2extraction to microalgae and plants［J］．Journal of Chemical Technology and Biotechnology，1995，62（1）：53－59．

［30］RAO A R，DAYANANDA C，SARADA R，et al．Effect of salinity on growth of green alga Botryococcus braunii and its constituents［J］．Bioresource Technology，2007，98（3）：560－564．