長期大負(fù)荷運動對大鼠空間學(xué)習(xí)記憶及海馬神經(jīng)粘附分子的影響

袁瓊嘉,李垂坤,李 雪,高丕明

(1.成都體育學(xué)院運動醫(yī)學(xué)系,四川 成都 610041;2.成都學(xué)院體育學(xué)院,四川 成都 610106; 3.四川省骨科醫(yī)院,四川 成都 610041)

長期大負(fù)荷運動對大鼠空間學(xué)習(xí)記憶及海馬神經(jīng)粘附分子的影響

袁瓊嘉1,李垂坤2,李 雪1,高丕明3

(1.成都體育學(xué)院運動醫(yī)學(xué)系,四川 成都 610041;2.成都學(xué)院體育學(xué)院,四川 成都 610106; 3.四川省骨科醫(yī)院,四川 成都 610041)

目的:研究7周大負(fù)荷游泳運動對大鼠空間學(xué)習(xí)記憶及海馬神經(jīng)粘附分子(NCAM)的影響。方法:雄性SD大鼠40只,隨機分為空白對照組(C組)、空白+水迷宮組(CM組)、大負(fù)荷運動組(HL組)和大負(fù)荷運動+水迷宮組(HLM組)4組,每組10只。C組和CM組常規(guī)飼養(yǎng),不加干預(yù)；HL組和HLM組進(jìn)行7周大負(fù)荷游泳運動。7周后,C組和HL組斷頭取海馬組織,采用Realtime PCR和Western blot檢測NCAM mRNA和蛋白表達(dá)；7周后,應(yīng)用Morris水迷宮檢測CM組和HLM組大鼠定位航行和空間探索次數(shù)。結(jié)果:(1)實驗期間,HL組大鼠體重第5-7周末均非常顯著低于C組(P＜0.01)；HLM組大鼠體重第4-7周末均非常顯著低于CM組(P＜0.01)。(2)Morris水迷宮平均逃避潛伏期,兩組在前3天的空間探索逃避潛伏期與后5天的學(xué)習(xí)記憶均有非常顯著性差異(P＜0.01),CM組第2～10天平均逃避潛伏期均顯著性短于第1天(P＜0.01),第3-10天平均逃避潛伏期均顯著性短于第2天(P＜0.05)；HLM組第2～10天平均逃避潛伏期均顯著性低于第1天(P＜0.01),第4-10天平均逃避潛伏期均顯著性短于第2天(P＜0.05)。Morris水迷宮空間探索實驗,HLM組平均穿越次數(shù)多于CM組(P＞0.05)。(3)HL組NCAM基因和蛋白表達(dá)均高于C組(P＜0.05)。結(jié)論:7周大負(fù)荷運動后雖然大鼠逃避潛伏期縮短了,空間探索穿越次數(shù)有所增加,但隨負(fù)荷增加,大鼠表現(xiàn)就越不穩(wěn)定,可能影響或阻礙大鼠學(xué)習(xí)記憶的形成；長期大負(fù)荷運動提高了大鼠海馬NCAM基因和蛋白表達(dá),提示其機制可能是參與了損傷后神經(jīng)的修復(fù)。

運動；學(xué)習(xí)；記憶；海馬；NCAM

隨著現(xiàn)代競技體育的飛速發(fā)展,體育競爭日趨激烈,為了戰(zhàn)勝對手,取得優(yōu)異運動成績,最大限度地挖掘人體的運動潛能,導(dǎo)致運動負(fù)荷接近甚至超出人體生理負(fù)荷的極限,進(jìn)而對機體產(chǎn)生一系列負(fù)面影響。近年來,大運動負(fù)荷引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)的紊亂現(xiàn)象倍受關(guān)注,研究表明神經(jīng)細(xì)胞黏附分子(Neural Cell Adhesion Molecule,NCAM)與神經(jīng)細(xì)胞軸突生長及延伸、神經(jīng)通路跨膜信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)、神經(jīng)纖維髓鞘及纖維束的形成、神經(jīng)細(xì)胞的識別及轉(zhuǎn)移、突觸形成及重塑、學(xué)習(xí)記憶的形成與鞏固等方面有著密切的關(guān)系[1-5]。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)是對不良刺激的最敏感部位,往往容易出現(xiàn)某些高級功能(如學(xué)習(xí)、記憶能力等)的紊亂。因此,本實驗對大鼠進(jìn)行大負(fù)荷游泳運動,采用Morris水迷宮進(jìn)行行為學(xué)測試,以大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的變化為突破口。通過對大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的測試以及了解海馬NCAM基因、蛋白的表達(dá)情況,探討大負(fù)荷運動后對大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力及其對相關(guān)基因的影響,為研究大負(fù)荷運動與海馬學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)機制提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物分組及訓(xùn)練方案

SPF級健康雄性SD大鼠40只購于成都達(dá)碩生物科技有限公司[動物生產(chǎn)許可證:CSXK(川)2008-24],體重為160～200g,8周齡。動物房環(huán)境溫度26 ±2℃,相對濕度50%～65%,大鼠分籠飼養(yǎng),自由飲水進(jìn)食,自然晝夜照明。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機為A、B兩組,20只/組。A組7周后再隨機分為2組(10只/組):空白對照組(Control,C組)和水迷宮組(Control and Morris,CM組)。B組7周游泳運動后再隨機分為2組(10只/組):大負(fù)荷運動組(Heavy Load,HL組)和大負(fù)荷運動+水迷宮組(Heavy Load and Morris, HLM組)。C組和CM組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)；HL組和HLM組大鼠進(jìn)行大負(fù)荷游泳運動。大鼠游泳運動方案參照袁瓊嘉[6]等人的實驗造模模型。待游泳結(jié)束后,斷頭取腦,并剝離海馬組織,裝入冷凍管,迅速放入液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 Morris水迷宮實驗

CM組和HLM組7周游泳運動結(jié)束后,進(jìn)行Morris水迷宮(MorrisWater Maze)實驗。本實驗Morris水迷宮的水池內(nèi)壁為黑色,直徑為150 cm、高60 cm的圓形水池,水溫控制在32±2℃,水中并加入墨水。在水池圓心作兩條相互垂直的直線將池壁分為4個象限,再將一個直徑為12 cm、高為45 cm的圓形黑色站臺放在靶象限(設(shè)為第一象限)內(nèi),站臺沒入水下2 cm。水池上方安置攝像機,用于同步記錄大鼠運動軌跡。實驗方案分2階段:第1階段進(jìn)行定位航行實驗(Place Navigation),所有大鼠均訓(xùn)練10天,1次/d。將大鼠面向池壁從每個象限邊緣中點入水,在水池上方有一攝像頭與電腦相連,可以通過電腦監(jiān)測并記錄大鼠從入水開始到爬上平臺的整個過程所需的時間(潛伏期)。若120 s內(nèi)未爬上平臺,將其放在平臺上10 s,以強化記憶,再放回籠中,該大鼠潛伏期記為120 s。第2階段為空間搜索實驗(Spatial Probe Test),在第1階段實驗結(jié)束后第二天進(jìn)行,實驗時去除平臺,然后從原來位置將大鼠面向池壁放入水中,記錄60 s內(nèi)大鼠穿越原有平臺的次數(shù)[6、7]。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 海馬NCAM mRNA的測定

取適量大鼠海馬組織,采用Trizol法提取總RNA,測定總RNA含濃度和純度,采用瓊脂糖凝膠電泳分析RNA的完整性。按TaKaRa試劑盒Prime ScriptTMReagent Kit反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。大鼠的目的基因NCAM和內(nèi)參基因β-actin的Real-time PCR擴增引物序列均參考林雪靈[7]等人研究設(shè)計的引物,本研究引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。Real-time PCR反應(yīng)按TaKaRa試劑盒SYBR?Premix Dimer EraserTM步驟進(jìn)行操作。反應(yīng)結(jié)束后,采用2-△△CT方法計算基因相對表達(dá)[6,7]。

1.3.2 海馬NCAM蛋白的測定

取適量海馬組織,按1g組織/20μl裂解液(含PMSF)進(jìn)行勻漿,冰水中靜置30 min,收集裂解液并離心取上清液。用裂解液進(jìn)行蛋白定量后,在100℃水浴鍋進(jìn)行蛋白質(zhì)變性10 min。采用碧云天BCA蛋白濃度測試試劑盒測定蛋白濃度。取蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離、轉(zhuǎn)膜,將轉(zhuǎn)膜好的PVDF膜置于5%BSA室溫封閉1 h后,孵育一抗(濃度為1∶2 000),振搖,4℃過夜。使用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗檢測目標(biāo)蛋白[6,7]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示,組間比較采用方差分析,P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體重變化情況

在游泳運動期間,每天對SD大鼠進(jìn)行體重檢測,取運動前和每周末的體重,由表1可知:與C組比較, HL組第5-7周末體重均非常顯著性低于C組并具有統(tǒng)計學(xué)意義；與CM組比較,HLM組第5-7周末體重均非常顯著性低于CM組并具有統(tǒng)計學(xué)意義,第2、4周末體重均顯著性低于CM組并具有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 各組大鼠體重每周末變化情況(單位:g)

2.2 Morris水迷宮檢測結(jié)果

2.2.1 定位航行平均逃避潛伏期檢測結(jié)果

利用Morris水迷宮進(jìn)行定位航行,由表2可知, CM和HLM組的各組大鼠的平均逃避潛伏期逐漸縮短。經(jīng)單因素方差分析,兩組在前3天的空間探索逃避潛伏期與后5天的學(xué)習(xí)記憶都有非常顯著性差異并具有統(tǒng)計學(xué)意義,第5-7天無顯著性差異；第8天后基本趨于穩(wěn)定。CM組第2～10天平均逃避潛伏期均非常顯著短于第1天(P＜0.01),第7、9天平均逃避潛伏期均非常顯著性短于第2天并具有統(tǒng)計學(xué)意義,第5-10天平均逃避潛伏期均顯著性短于第2天并具有統(tǒng)計學(xué)意義；HLM組第2～10天平均逃避潛伏期均非常顯著性低于第1天并具有統(tǒng)計學(xué)意義,第5-10天平均逃避潛伏期均非常顯著性短于第2天并具有統(tǒng)計學(xué)意義,第3、4天平均逃避潛伏期均顯著性短于第2天并具有統(tǒng)計學(xué)意義。與CM組相比,HLM組第9、10天平均逃避潛伏期均長于CM組并無統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 CM和HM組定位航行平均逃避潛伏期(單位:s)

2.2.2 空間探索平均穿越次數(shù)檢測結(jié)果

利用Morris水迷宮進(jìn)行的空間探索實驗中,HLM組平均穿越次數(shù)(0.41±0.14)多于CM組(0.50±0.25,P＜0.05)并無統(tǒng)計學(xué)意義,但表現(xiàn)出對原有平臺的搜索。

2.3 大鼠海馬NCAM mRNA表達(dá)結(jié)果

SD大鼠海馬NCAM基因檢測結(jié)果(表3)與C組相比,HL組基因表達(dá)(0.86±0.04)顯著高于C組(0.65±0.04,P＜0.05)并具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.4 大鼠海馬NCAM蛋白表達(dá)結(jié)果

SD大鼠海馬NCAM蛋白檢測結(jié)果(表3)與C組相比,HL組蛋白表達(dá)(0.41±0.02)顯著高于C組(0.27±0.01,P＜0.05)并具有統(tǒng)計學(xué)意義。

表3 海馬NCAM mRNA與蛋白表達(dá)變化

3 討論

3.1 長期大負(fù)荷運動對大鼠體重的影響

本研究實驗結(jié)果證明,7周游泳運動后大鼠體重雖然都有所增加,但是空白對照組大鼠體重的增加速率明顯大于大負(fù)荷運動組。我們可以推斷:一方面,長時間大負(fù)荷運動消耗了機體大量能量,代謝相應(yīng)增加,進(jìn)而減少了脂肪及蛋白質(zhì)在體內(nèi)的合成；另一方面由于運動過度,食欲下降,從而減少了能量的攝入,所以空白對照組大鼠的體重增加相對緩慢。提示隨著運動時間的延長和運動負(fù)荷的增加,大鼠體重的增加速率也就越緩慢,證明本課題游泳運動造模比較成功。

3.2 長期大負(fù)荷運動對大鼠空間學(xué)習(xí)記憶的影響

20世紀(jì)80年代初,Morris水迷宮是英國心理學(xué)家Morris設(shè)計的,并應(yīng)用與腦的學(xué)習(xí)記憶機制的研究。該迷宮系統(tǒng)是測定動物空間位置覺和方向覺(空間定位)的學(xué)習(xí)記憶能力的行為較為理想的實驗?zāi)Ｐ?。此?在神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究中被廣泛運用[8]。在本實驗中發(fā)現(xiàn),隨著Morris水迷宮訓(xùn)練時間的推移,CM組與HLM組大鼠的逃避潛伏期的時間越來越短。CM組與HLM組的測試結(jié)果盡管沒有顯著性差異,但HLM組的定位航行平均逃避潛伏期非常不穩(wěn)定,隨負(fù)荷的增加所需時間長于CM組,說明隨游泳運動負(fù)荷的遞增,導(dǎo)致大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力下降。此結(jié)果提示我們長期大負(fù)荷游泳運動后,影響或阻礙了大鼠空間學(xué)習(xí)記憶的形成。這與國內(nèi)外相關(guān)研究結(jié)果一致[9-10]。如周慧[11]等人應(yīng)用MG-3Y型迷宮對小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行測試,發(fā)現(xiàn)高運動負(fù)荷組與對照組相比總電擊時間、總訓(xùn)練次數(shù)、錯誤反應(yīng)次數(shù)均明顯增加,正確反應(yīng)率顯著下降,表明過高的運動負(fù)荷降低了大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

3.3 長期大負(fù)荷運動對SD大鼠海馬NCAM的影響

在1976年,Rutishauser等首先在雞的視網(wǎng)膜和腦中發(fā)現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞粘附分子(NCAM),它是細(xì)胞表面糖蛋白大家族的一組成員,介導(dǎo)細(xì)胞粘附和識別的胞膜糖蛋白、影響神經(jīng)發(fā)育及損傷修復(fù)、神經(jīng)通路的形成、信號傳導(dǎo)過程、學(xué)習(xí)記憶形成、突觸可塑性及重塑等多個神經(jīng)身體過程[12、14]。

研究結(jié)果表明,不同運動負(fù)荷、方式與方法等都可能對機體造成不同的影響,而對海馬中NCAM與學(xué)習(xí)記憶的作用和意義主要集中在適量運動或有氧運動。如袁瓊嘉[6]等研究發(fā)現(xiàn)SD大鼠長期適宜運動后,長期中等負(fù)荷運動組海馬NCAM的基因和蛋白均顯著高于空白對照組,說明長期適宜的有氧運動提高了大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。而在長期大負(fù)荷運動中研究甚少,本實驗研究結(jié)果表明,HL組大鼠海馬NCAM基因和蛋白均明顯高于C組。長期大負(fù)荷運動后,海馬內(nèi)NCAM誘導(dǎo)生成有所升高,通過突觸重塑、軸突再生的促進(jìn)作用但無中等負(fù)荷運動的效果好[6],這可能與海馬組織損傷有一定的關(guān)系。隨著運動負(fù)荷的增加,一方面,神經(jīng)沖動的傳導(dǎo)速率增加、神經(jīng)遞質(zhì)釋放增多,進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)“興奮毒性”；另一方面,能源物質(zhì)的大量消耗、ATP合成速率下降,進(jìn)而導(dǎo)致“能量耗竭”等。近來研究也表明,在神經(jīng)受損后,PSA-NCAM的表達(dá)會增加,NCAM可能參與了損傷后神經(jīng)的修復(fù)[15]。張曉巖[16]等研究發(fā)現(xiàn)高原低氧應(yīng)激反應(yīng)后,大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞NCAM基因表達(dá)先降低后升高,提示在高原低氧條件下可以通過上調(diào)NCAM mRNA表達(dá),增加NCAM蛋白的合成,從而起到保護(hù)修復(fù)作用。

4 結(jié)論

(1)通過7周大負(fù)荷游泳運動,雖然大鼠逃避潛伏期縮短了,空間探索穿越次數(shù)有所增加,但隨負(fù)荷增加,大鼠表現(xiàn)就越不穩(wěn)定,可能影響或阻礙了大鼠空間學(xué)習(xí)記憶的形成。

(2)通過7周大負(fù)荷游泳運動,運動組海馬NCAM的mRNA和蛋白表達(dá)都有不同水平的增高。提示可能參與了損傷后神經(jīng)的修復(fù),其原因及機制還有待進(jìn)一步的研究。

參 考 文 獻(xiàn)

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Effect of Long-Term Heavy Load Exercise on the Spatial Learning and M emorizing Abilities and NCAM in Rats'Hippocam pus

YUAN Qiong-Jia,et al
(Chengdu Sport University,Chengdu Sichuan,610041)

Objective:The purpose is to investigate the effect of long-term heavy load swimming exercise on the spatial learning andmemorizing abilities and the expression of neural cell adhesionmolecule(NCAM)in hippocampus of SD rats.Methods:40 male ratswere randomly divided into 4 groups as follows(n=10 in each group):control group (C),control group and Morrismaze(CM),and both were conventionally bred without intervening；7 weeks ofmoderate swimming exercise were given to heavy load exercise group(HL)and Morrismaze group(HLM).After 7 weeks,the brain of the C and HL group's ratswere taken out to test themRNA and protein of NCAM through real-time PCR and Western Blotting.The navigation and space exploration ability of CM and HLM were tested through Morriswatermaze. Results:1.In the period of swimming,the weight of HL group rats was significantly lower than that of C group at 5,6 and 7 weekends(p＜0.01)；the weight of HLM group ratswas significantly lower than that of CM group at4,5,6 and 7 weekends(P＜0.05,P＜0.01).2.After Morrismaze training,the early 3 days evasion incubation period of the two groups and the last5 days ability of learning and memory had a significantly difference(p＜0.01).The average escape latency of CM group from 2 to 10 dayswas significantly lower than the first day(p＜0.01),and it became significantlylower from 3rd to 10th days than the second day(p＜0.05,p＜0.01)；the average escape latency of HLM group from the 2nd to 10th dayswas significantly lower than the first day(p＜0.01),and itwas significantly lower from 4th to 10th days than the second day(p＜0.05,p＜0.01).After Morrismaze training,the average traversing times of HLM group weremore than those in CM group(p＞0.05).3.The expression of NCAM gene and protein of the HL group ratswere significantly more active than the C group rats(P＜0.05).Conclusion:Although 7-weeks of long-term heavy load exercise can shorten the evasion incubation period of locating swimming and enhance the passing frequency of spatial exploring of rats,within the increase of load and the accumulation of fatigue,the rats behavedmore unstably and itwill affect the formation of learning andmemory in rats；long-term heavy load exercise is conducive to the promotion of NCAM expression in rats hippocampus,which shows that themechanism may be associated with the repairmen of injured nerves.

exercise；learning；memorizing；hippocampus；NCAM

G804.2

:A

:1001-9154(2014)11-0079-05

G804.2

:A

:1001-9154(2014)11-0079-05

國家自然科學(xué)基金(31371202)；四川省科技廳科技支撐計劃項目(2012SZ0067)；國家體育總局、四川省運動醫(yī)學(xué)重點實驗室；四川省高校科研創(chuàng)新團(tuán)隊專項基金。

袁瓊嘉(1956–),女,重慶北碚人,教授,博士,博士生導(dǎo)師,研究方向:運動與健康促進(jìn)。

2014-08-10