榆耳液體發(fā)酵菌絲體多糖提取方法的比較研究

郭海勇，邢曉瑞，何云亭，韓 育，李彬彬，鮑慶晗，孫文怡，于長(zhǎng)春

(吉林師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 四平 136000)

榆耳(Gloeostereum incaratum)，又稱榆磨，是分布于中國東北部山區(qū)和日本北海道地區(qū)的一種稀有食藥用真菌，近年來隨著對(duì)榆耳多糖的深入研究，榆耳多糖的多種生物活性被發(fā)現(xiàn)，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等功效［1-3］.因其對(duì)人體正常細(xì)胞毒副作用很小，具有良好的提高機(jī)體免疫力的作用［4-5］，并無毒副作用，可廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥及保健食品領(lǐng)域，具有廣闊的發(fā)展前景，因此有效提取榆耳多糖具有重要意義.

真菌多糖在細(xì)胞中一直作為能量存儲(chǔ)分子和結(jié)構(gòu)組成的角色，因其獨(dú)特的功能和較低的毒性，已在抗腫瘤藥、抗病毒藥、抗衰老藥等多個(gè)方面得到開發(fā)和應(yīng)用［6］，食藥用真菌多糖的提取多見于水提和堿提法，而酶法和超聲波法近年來也不斷被應(yīng)用.但是針對(duì)不同的食用菌，其有效的提取方法各不相同，因此本實(shí)驗(yàn)采用水法、酶法及超聲波法對(duì)榆耳發(fā)酵菌絲體多糖的提取方法進(jìn)行比較研究，為應(yīng)用最佳提取方法的工藝優(yōu)化研究和榆耳多糖免疫功能研究奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

(1)菌種.榆耳 G105(Gloeostereum incarnatum S.Ito et Imai)，購自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)菌物研究中心.

(2)試劑.纖維素酶、中性蛋白酶由寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司生產(chǎn).葡萄糖、三氯甲烷、正丁醇、乙醇、苯酚等試劑均為市售分析純?cè)噭?

(3)儀器設(shè)備.UV-4802型分光光度計(jì)，美國Unico公司;Vortex-Genie 2型旋渦混合儀，美國SI公司;RE52299型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠;HH2S型恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠;JY92-IIDN超聲波破碎儀，寧波新芝公司.

1.2 方法

(1)榆耳菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)及菌絲體干粉的制備.將榆耳G105斜面試管菌種接種于PDB液體培養(yǎng)基，26℃、120 r/min培養(yǎng)7 d制成液體母種，以10%接種量接入液體搖瓶培養(yǎng)基中，26℃，120 r/min，培養(yǎng)7 d得到菌絲體.將菌絲體用4層紗布過濾，用蒸餾水反復(fù)洗滌3次，60℃恒溫烘干，粉碎成干粉，備用.

(2)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定.分別吸取0.1mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL、1.6mL，均以蒸餾水補(bǔ)至2.0mL.然后加入6%苯酚溶液1mL，在加入濃硫酸5mL，漩渦充分搖勻，沸水浴15min，冰浴5min，在波長(zhǎng)490nm處測(cè)定吸光值A(chǔ).并以A為縱坐標(biāo)，溶液中葡萄糖含量為橫坐標(biāo)繪圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程.

(3)水提法提取榆耳菌絲體多糖.準(zhǔn)確稱取1.0 g榆耳菌絲干粉，料液比1∶30，80℃恒溫水浴中浸提2.5 h，過濾，重復(fù)2次，合并上清液，減壓蒸餾濃縮至原體積的1/10.冷卻后Sevage法除蛋白:按多糖溶液體積加入比為5∶1的三氯甲烷和正丁醇混合液，劇烈振蕩20min，棄去下層有機(jī)溶液層和中間變性蛋白質(zhì)，重復(fù)2次.除蛋白后的提取液加入終濃度為3%的過氧化氫，在50℃下保溫脫色20min，加入3倍體積無水乙醇，4℃靜置過夜，4000 r/min離心15min，收集沉淀，60℃烘干至恒重，稱重，采用苯酚–硫酸法測(cè)定榆耳發(fā)酵液中多糖含量，計(jì)算其得率，試驗(yàn)重復(fù)3次.

(4)酶法提取榆耳菌絲體多糖.準(zhǔn)確稱取1.0 g榆耳菌絲干粉，料液比1∶30，調(diào)節(jié)pH為4.5，加入3%的纖維素酶，40℃作用30min，再調(diào)pH至7.5加3%中性蛋白酶作用30min，升溫至80℃滅酶30min，4000 r/min離心 15min，取上清液，沉淀反復(fù)洗滌2次，合并上清液，減壓蒸餾濃縮至原體積的1/10.采用Sevage法除蛋白，脫色，醇沉，干燥，苯酚–硫酸法測(cè)定榆耳發(fā)酵液中多糖含量，計(jì)算其得率，試驗(yàn)重復(fù)3次.

(5)超聲波法提取榆耳菌絲體多糖.準(zhǔn)確稱取1.0 g榆耳菌絲干粉，料液比1∶30，功率為600 W，超聲時(shí)間為30min，4000 r/min離心15min，取上清液，沉淀反復(fù)洗滌2次，合并上清液，減壓蒸餾濃縮至原體積的1/10.采用 Sevage法除蛋白，脫色，醇沉，干燥，苯酚–硫酸法測(cè)定榆耳發(fā)酵液中多糖含量，計(jì)算其得率，試驗(yàn)重復(fù)3次.

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的確定

精確量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL、1.6mL用蒸餾水分別補(bǔ)至2.0mL，按苯酚–硫酸法比色測(cè)定吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖質(zhì)量濃度(x，mg/mL)為橫坐標(biāo)、吸光度(y)為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖1)，其回歸方程為 y=12.70x － 0.0019，R2=0.9986.葡萄糖質(zhì)量濃度在 0.00 ～0.10mg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.

圖1 葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 三種不同提取方法多糖提取率結(jié)果比較

采用水提取法、酶法提取法、超聲波提取法3種方法對(duì)一定量的榆耳菌絲體進(jìn)行多糖提取，其多糖提取率比較結(jié)果見圖2.

圖2 不同提取方法提取榆耳菌絲體多糖提取率的比較結(jié)果

從圖2可以看出，酶法多糖提取率最高，達(dá)到4.70%，其次是超聲波法，多糖提取率為3.92%，且用時(shí)最短.水提取法提取率最低，為3.47%，且操作時(shí)間最長(zhǎng)，但超聲波法與水提取法差異不顯著.

3 結(jié)論

熱水提取法是提取真菌多糖的傳統(tǒng)方法，工藝簡(jiǎn)單，設(shè)備要求低，能夠最大限度地保持多糖的結(jié)構(gòu)和活性，但操作時(shí)間長(zhǎng)，提取效低率.應(yīng)用水提法提取榆耳菌絲體多糖，粗多糖得率為3.47%，低于張公亮等［6］水提醇沉法提取多糖的得率.超聲波法是目前提取真菌多糖的最快速經(jīng)濟(jì)的方法，是利用超聲波的空化作用及各種次級(jí)效應(yīng)瞬時(shí)產(chǎn)生大量熱能，加速有效成分溶出，提高多糖的提取率和純度，縮短提取時(shí)間、降低能耗，并避免了高溫對(duì)多糖結(jié)構(gòu)和活性的影響，提取過程中需注意超聲時(shí)間，過長(zhǎng)會(huì)引起多糖的分解［7，8］.但本研究采用超聲波提取榆耳菌絲體多糖的效果并不理想，和水提法無明顯差異且低于酶法的提取率.

復(fù)合酶法提取真菌多糖是近幾年發(fā)展起來的一種新技術(shù)，針對(duì)真菌多糖分布部位及細(xì)胞結(jié)構(gòu)特征的不同，恰當(dāng)?shù)乩酶鞣N酶的協(xié)同作用改變細(xì)胞壁的通透性，破壞菌體細(xì)胞結(jié)構(gòu)，最大限度地提高多糖的得率，同時(shí)保持多糖的活性構(gòu)象和藥用功能，酶法技術(shù)應(yīng)用于天然產(chǎn)物的提取制備操作簡(jiǎn)便，成本低廉。此方法已在真菌多糖提取中廣泛應(yīng)用，并取得較好的效果［10，11］.本研究采用復(fù)合酶解法提取液態(tài)深層發(fā)酵培養(yǎng)獲得的榆耳菌絲體多糖，得率高于傳統(tǒng)的熱水提取法和超聲波提取法，與劉振春等［9］通過酶法提取榆耳菌絲體多糖的得率相似.本研究通過對(duì)三種不同提取榆耳菌絲體多糖的方法進(jìn)行比較研究，確定酶法提取效果最好，榆耳菌絲體多糖提取率高于其他兩種方法，為榆耳菌絲體多糖提取工藝優(yōu)化及進(jìn)一步研究榆耳多糖性質(zhì)和功能奠定基礎(chǔ).

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