枯草芽孢桿菌BJ3-2精氨酸脫羧酶基因speA的克隆與序列分析

劉艷敏，盧 彪，沈璽龍，王 濤，吳擁軍*

（貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

精氨酸脫羧酶（arginine decarboxylase，ADC）廣泛分布于細(xì)菌、真菌、古生菌和植物體內(nèi)，在多胺生物合成過程中扮演重要的角色[1]，是多胺合成途徑中關(guān)鍵酶[2-3]。在枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）中多胺生物合成只有一條途徑：始于精氨酸（arginine）[4]，由精氨酸脫羧酶作用脫羧生成的胍基丁胺（agmatine），經(jīng)過胍基丁胺酶（agmatinase）水解生成腐胺（putrescine，Put）和尿素（urea）[1，5]；腐胺與脫羧S-腺苷甲硫氨酸（dAdoMet，dSAM）[6]提供的氨丙基在亞精胺合成酶（spermidine synthase）或精胺合成酶（spermine synthase）的催化作用下合成亞精胺（spermidine，Spd）或精胺（spermine，Spm）[2，7-9]。適量的生物胺在人和動(dòng)物活細(xì)胞中發(fā)揮著重要的生理作用，但當(dāng)體內(nèi)生物胺含量過高或超過一定范圍則會(huì)引起身體不適等不良癥狀，還具有潛在的致癌性[10]。生物胺存在于食品中也會(huì)影響甚至改變其風(fēng)味成分[11-12]；同時(shí)精胺和亞精胺的存在會(huì)影響食品的風(fēng)味和品質(zhì)，產(chǎn)生難聞的氣味，還可能與亞硝酸鹽結(jié)合形成致癌的亞硝胺[10]。多聚胺如腐胺、尸胺、精胺和亞精胺等對(duì)人體沒有直接毒性，但會(huì)加強(qiáng)組胺和酪胺對(duì)人體解毒系統(tǒng)的影響。

目前貴州地區(qū)水豆豉生產(chǎn)主要以自然發(fā)酵為主，其中發(fā)酵的主要微生物枯草芽孢桿菌，擁有悠久的酶生產(chǎn)和食品發(fā)酵歷史，是細(xì)菌型水豆豉生產(chǎn)的主要食品安全發(fā)酵菌株。發(fā)酵食品中的生物胺主要由微生物通過分泌脫羧酶而生成，據(jù)報(bào)道芽孢桿菌具有氨基酸脫羧酶活性，張建華等[13]報(bào)道了納豆發(fā)酵過程中產(chǎn)生的生物胺主要以亞精胺為主。納豆和水豆豉都屬于發(fā)酵大豆食品，為控制水豆豉生產(chǎn)過程產(chǎn)生過量的亞精胺和精胺及其副產(chǎn)物，以實(shí)驗(yàn)室前期已獲得豆豉生產(chǎn)菌株Bacillus subtilisBJ3-2[14-15]為目標(biāo)菌株，根據(jù)GenBank中枯草芽孢桿菌168菌株的精氨酸脫羧酶基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，以Bacillus subtilisBJ3-2基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆精氨酸脫羧酶基因speA，并與其他枯草芽孢桿菌的speA序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析，推測(cè)ADC酶活性結(jié)構(gòu)域和酶活性位點(diǎn)，從而為產(chǎn)亞精胺和精胺的枯草芽孢桿菌的檢測(cè)提供理論依據(jù)，也為ADC活性影響因素的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)，為水豆豉的安全生產(chǎn)提供一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Bacillus subtilisBJ3-2和E.coliDH5α：本實(shí)驗(yàn)室保存。

pGEM-T載體：美國(guó)Promega公司；基因組DNA提取試劑盒、溶菌酶：美國(guó)Promega公司；Taq（聚合）酶、T4 DNA連接酶、DNAMarker、dNTPs、10×PCRBuffer等：大連TaKaRa公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。E.Z.N.A.TMGel Extraction Kit（200）膠回收試劑盒、E.Z.N.A.TMPlasmid Mini KitⅠ（200）質(zhì)粒提取試劑盒：美國(guó)Omega公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MyCycler PCR儀、Universal Hood Ⅱ凝膠成像分析儀、PowerPac HC電泳儀：美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

參考GenBank中枯草芽孢桿菌168菌株（登錄號(hào)為AL009126.3）的精氨酸脫羧酶基因序列，應(yīng)用DNAStar軟件設(shè)計(jì)一對(duì)精氨酸脫羧酶基因的特異性引物，引物序列：上游引物P1：5′-TTGTCGCAACATGAAACAC-3′；下游引物P2：5′-TTATTGAATTGCTTTTTGTTC-3′；預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1 473bp，由北京諾賽基因組研究中心有限公司合成。

1.4 方法

1.4.1Bacillus subtilisBJ3-2基因組DNA的提取

挑取B.subtilisBJ3-2單菌落，接種到5mL LB培養(yǎng)基中，37℃條件下振蕩培養(yǎng)過夜，參考Promega公司的革蘭氏陽性細(xì)菌中提取基因組的試劑盒說明書提取全基因組。

1.4.2 PCR擴(kuò)增

以提取的B.subtilisBJ3-2的基因組DNA為模板，用合成的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系：DNA模板1μL、dNTPs 1.6μL、10×PCR Buffer 2μL、上下游引物各0.5μL、Taq酶0.1μL、ddH2O 14.3μL?？傮w系：20μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)熱5min，94℃變性40s，50℃退火40s，72℃延伸90s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10min，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4.3 精氨酸脫羧酶基因（speA）的克隆與鑒定

將回收純化的PCR產(chǎn)物與pGEM-T載體按常規(guī)方法[16]進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α。將菌落PCR和質(zhì)粒PCR驗(yàn)證正確的克隆質(zhì)粒送北京諾賽基因組研究中心有限公司測(cè)序。

1.4.4speA序列分析

用DNAStar和MEGA5生物學(xué)軟件對(duì)speA基因的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行編輯，與GenBank中已發(fā)表的其他speA基因序列進(jìn)行同源性分析并繪制ADC遺傳進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bacillus subtilis BJ3-2基因組DNA的提取

用基因組提取試劑盒，對(duì)B.subtilisBJ3-2基因組DNA進(jìn)行提取，DNA樣品經(jīng)0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。圖1顯示所提取的B.subtilisBJ3-2基因組DNA較完整，無顯著降解，可用作模板進(jìn)行下一步目的基因的PCR擴(kuò)增。

圖1 枯草芽孢桿菌BJ3-2基因組Fig.1 Genome of Bacillus subtilis BJ3-2

2.2 speA基因的PCR擴(kuò)增

以B.subtilisBJ3-2基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增speA基因，1%的瓊脂糖凝膠電泳，擴(kuò)增出一條約與預(yù)期片段大小1 473bp相符的條帶，結(jié)果見圖2。

圖2 PCR擴(kuò)增speA基因Fig.2 PCR amplification of speA

2.3 重組克隆質(zhì)粒的菌落PCR鑒定

PCR產(chǎn)物純化后與pGEM-T 載體連接過夜，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α。通過菌落PCR檢測(cè)，從圖3可以看出，約在1 473bp處出現(xiàn)了特異性擴(kuò)增條帶，與基因組PCR擴(kuò)增speA的目的條帶大小相吻合，獲得了陽性的重組菌落。

圖3 菌落PCR鑒定重組子Fig.3 PCR rapid identification of speA gene from recombinant clones

2.4 重組質(zhì)粒PCR鑒定

將鑒定的陽性重組菌落進(jìn)行增菌培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)行質(zhì)粒PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明，約在1 473bp處出現(xiàn)一特異性條帶，所獲得的基因片段大小均與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小相吻合（見圖4），說明目的基因已正確克隆至pGEM-T載體中，并將提取的重組質(zhì)粒送生物公司測(cè)序，并命名為pGEM-speA。

圖4 質(zhì)粒PCR鑒定Fig.4 PCR identification of speA from recombinant plasmid pGEM-speA

2.5 Bacillus subtilis BJ3-2精氨酸脫羧酶基因speA的同源性分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹

測(cè)序結(jié)果經(jīng)DNAStar 軟件編輯處理，結(jié)果表明，B.subtilisBJ3-2精氨酸脫羧酶基因speA開放閱讀框大小為1 473bp，編碼490個(gè)氨基酸，推測(cè)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為53.53ku，G+C含量為44%，等電點(diǎn)為5.29，酸性氨基酸19.6%，堿性氨基酸12.2%。將序列提交至GenBank中，獲得基因登錄號(hào)為KJ561348。

將所克隆的基因序列和推導(dǎo)的蛋白序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列同源性比對(duì)，分析結(jié)果表明，B.subtilisBJ3-2的speA基因序列與已報(bào)道枯草芽孢桿菌的speA基因序列和蛋白序列高度同源，分別達(dá)到93%和95%以上，核苷酸序列與Bacillussp.JS（speA）的同源性最高，達(dá)99%；與其他枯草芽孢桿菌（speA）的核苷酸序列也在93%及其以上；與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）和萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus）的同源性為79%，表明克隆的基因?yàn)榫幋a精氨酸脫羧酶的基因。

B.subtilisBJ3-2精氨酸脫羧酶氨基酸序列與芽孢桿菌JS（Bacillussp.JS）、枯草芽孢桿菌168菌株（Bacillus subtilis168）、枯草芽孢桿菌納豆亞種BEST195菌株（Bacillus subtilis subsp.natto BEST195）、枯草芽孢桿菌BEST7613（Bacillus subtilisBEST7613）最高，為99%；與其他枯草芽孢桿菌精氨酸脫羧酶氨基酸序列在≥97%；與芽孢桿菌屬其他菌種的精氨酸脫羧酶氨基酸序列同源性在97%～72%之間。

乳酸菌（Lactobacillussp.30a）的鳥氨酸脫羧酶家族（ornithine decarboxylase family）作為大多數(shù)細(xì)菌磷酸吡哆醛（pyridoxal 5'-phosphate，PLP）依賴型脫羧酶代表，具有Ⅲ型PLP型脫羧酶的活性位點(diǎn)和PLP結(jié)合位點(diǎn)以及二級(jí)結(jié)構(gòu)特征[17]，選擇Lactobacillussp.30a的ODC氨基酸序列作比對(duì)，推測(cè)B.subtilisBJ3-2的ADC底物結(jié)合位點(diǎn)和酶活性位點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，Ⅲ型PLP型脫羧酶和厚壁菌門細(xì)菌的PLP依賴型脫羧酶與大腸桿菌的保守結(jié)構(gòu)區(qū)域不同[17-18]，嗜熱厭氧解木聚糖桿菌（Thermoanaerobacterium xylanolyticumLX-11）和梭狀芽孢桿菌（Clostridium stercorariumsubsp.stercorariumDSM 8532）都屬于厚壁菌門細(xì)菌，選擇二者的ADC序列作比對(duì)，增加推測(cè)B.subtilisBJ3-2的底物結(jié)合位點(diǎn)和酶活性位點(diǎn)的可靠性；并根據(jù)大腸桿菌E.coliATCC 8739 ADC 和Lactobacillussp.30a ODC、B.subtilis168 ADC 和T.xylanolyticumLX-11 ADC、C.stercorariumDSM 8532 ADC的氨基酸序列以及同源性較高的枯草芽孢桿菌ADC序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)一步分析其間的進(jìn)化關(guān)系。

ClustalW多序列比對(duì)，GeneDoc輸出，結(jié)果顯示B.subtilisBJ3-2的ADC基因包括有PLP依賴型脫羧酶家族的氨基酸保守結(jié)構(gòu)域：即PLP結(jié)合位點(diǎn)：[FDSAW]、[RNNHKSVYNSA]、[S-X-H-K]；[S-X-H-K]序列中Lys（K）是PLP依賴型脫羧酶的活性位點(diǎn)，PLP通過與Lys氨基酸殘基形成醛亞胺鍵（席夫堿），使酶具有催化活性[17]，如圖5所示。

從圖6可以看出，枯草芽孢桿菌的ADC位于遺傳距離較近的同一進(jìn)化分支，彼此親緣關(guān)系較近，B.subtilisBJ3-2的與B.subtilis168的ADC遺傳距離最近，與T.xylanolyticumLX-11和C.stercorariumDSM8532的遺傳距離次之。B.subtilisBJ3-2的ADC與Lactobacillussp.30a的ODC位于遺傳距離稍遠(yuǎn)的同一進(jìn)化分支，與E.coliATCC 8739的ADC遺傳距離最遠(yuǎn)。以上分析顯示B.subtilisBJ3-2與乳酸菌和其他厚壁菌門細(xì)菌的遺傳距離較近，具有Lactobacillus.30a鳥氨酸脫羧酶家族（ornithine decarboxylase family）相似的保守結(jié)構(gòu)域，屬于典型的III型磷酸吡哆醛（pyridoxal phosphate，PLP）依賴型鳥氨酸/賴氨酸/精氨酸脫羧酶家族（Orn/Lys/Arg decarboxylase family）成員[17-18]。

圖5 B.subtilis BJ3-2和其他細(xì)菌ADC/ODC的氨基酸多序列比對(duì)Fig.5 ADC/ODC amino acid multiple sequence alignments between B.subtilis BJ3-2 and other bacteria

圖6 不同細(xì)菌的ADC/ODC氨基酸序列遺傳進(jìn)化樹Fig.6 Genetic evolutionary tree of ADC/ODC amino acid sequences of different bacteria

3 結(jié)論與討論

Bacillus subtilisBJ3-2的ADC基因編碼的脫羧酶屬于丙氨酸消旋酶（alanine racemase）家族，其的功能依賴于PLP位點(diǎn)，屬于典型的III型PLP依賴型鳥氨酸/賴氨酸/精氨酸脫羧酶家族成員。在[FDSAW]結(jié)構(gòu)域中，天冬氨酸Asp（D）與丙氨酸Ala（A）高度保守，Asp在酶催化過程中能穩(wěn)定電荷，Ala的甲基側(cè)鏈處在酶輔助因子的后面，對(duì)于酶的空間構(gòu)象具有重要作用。[S-X-H-K]序列高度保守，組氨酸His（H）在PLP底物結(jié)合去質(zhì)子化過程中提供質(zhì)子，穩(wěn)定電荷，該位點(diǎn)的定點(diǎn)突變對(duì)酶活性會(huì)產(chǎn)生影響[19]。[RNNHKSVYNSA]中His存在所有的PLP依賴型脫羧酶中，代表了轉(zhuǎn)氨酶向脫羧酶進(jìn)化的一個(gè)最重大的特征，His殘基在特定的組胺?；噭┬揎椇髸?huì)使酶失活[17，20]。在不同細(xì)菌ADC的序列比對(duì)中還存在[GTS]、[STSPFY]、[YPPG]、[PGE]高度保守序列，這可能其他輔助因子相關(guān)。PLP型輔助因子通過氫鍵、π-堆積以及范德華力相互作用，以確保ADC酶活性，保守結(jié)構(gòu)域和活性位點(diǎn)的分析對(duì)于酶活性調(diào)控具有重要作用。

在枯草芽孢桿菌中，以ATG為起始密碼子的基因的占78%，以TTG為起始密碼子的占13%，以GTG的占9%。大腸桿菌中的起始tRNA分子可以同時(shí)識(shí)別AUG、GUG和UUG這3種起始密碼子，但識(shí)別頻率并不相同，通常GUG為AUG的50%，而UUG只及AUG的25%[21]。以實(shí)驗(yàn)?zāi)康木闎.subtilisBJ3-2克隆得到的speA基因的起始密碼子為TTG，是枯草芽孢桿菌中特有的遺傳起始密碼子，在精氨酸脫羧酶基因的表達(dá)后續(xù)試驗(yàn)中需要選擇合適的表達(dá)載體和宿主菌，或在大腸桿菌中表達(dá)宿主細(xì)胞中進(jìn)行密碼子優(yōu)化，增強(qiáng)精氨酸脫羧酶基因的表達(dá)效率。

在革蘭氏陽性菌枯草芽孢桿菌中生物多胺合成只有一條途徑，起始于精氨酸，由精氨酸脫羧酶、胍基丁胺酶、S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶以及亞精胺合酶、精胺合酶共同參與作用。實(shí)驗(yàn)應(yīng)該同時(shí)研究這幾個(gè)基因，以進(jìn)一步了解枯草芽孢桿菌生物多胺的合成途徑，speA基因的克隆與ADC酶保守結(jié)構(gòu)域和酶活性位點(diǎn)的推測(cè)，為有效控制水豆豉產(chǎn)品中生物胺的含量和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)以及植物抗性關(guān)于精氨酸脫羧酶[6，22]的相關(guān)研究提供一定的理論依據(jù)。

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