食醋中絮狀物產(chǎn)生菌的分離鑒定及檢測(cè)方法研究

薛建華，梁建明，王福中

（四川清香園調(diào)味品股份有限公司，四川 江油 621700）

我國(guó)釀醋歷史悠久，莊頒著《物原類考》有載“醬成于鹽，周時(shí)已有醋，一名苦酒，周時(shí)稱醯，漢始稱醋”[1]。近年來(lái)，食醋行業(yè)發(fā)展迅速，食醋品種不斷豐富，包裝容器除傳統(tǒng)的玻璃瓶之外，塑料瓶、塑料軟袋等也被廣泛應(yīng)用。塑料包裝外觀多樣，且不易破碎，方便運(yùn)輸，但其透氣性大于玻璃瓶，塑料材質(zhì)尤其軟袋包裝的食醋中容易出現(xiàn)絮狀物，進(jìn)而影響產(chǎn)品質(zhì)量[2]，這一現(xiàn)象在食醋行業(yè)中普遍存在。對(duì)食醋中絮狀物的產(chǎn)生菌進(jìn)行了分離鑒定，并確定了該菌的檢測(cè)方法，采用馬鈴薯液體培養(yǎng)基最快可在24h內(nèi)對(duì)結(jié)果作出判定，能有效防止不合格品出廠，對(duì)指導(dǎo)食醋生產(chǎn)具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

食醋：四川清香園調(diào)味品股份有限公司提供；馬鈴薯：市售；酵母膏、瓊脂粉（生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；葡萄糖、碳酸鈣、無(wú)水乙醇（分析純）：成都市科龍化工試劑廠。

液體培養(yǎng)基：馬鈴薯汁1000mL，葡萄糖20g，pH5.5～6.0；

平板培養(yǎng)基：蒸餾水1 000mL，酵母膏10g，葡萄糖10g，無(wú)水乙醇20mL，碳酸鈣15g，瓊脂粉15～20g；

馬鈴薯汁制備方法：稱取去皮、切塊的馬鈴薯200g，加入1 000mL蒸餾水，煮沸20～30min，用多層紗布過(guò)濾，濾液加水定溶至1 000mL。

1.2 儀器與設(shè)備

SYQ-DSX-280A手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；AL204電子分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；EC3001生物顯微鏡：江西江鳳儀器科技有限公司；DHG-9140A電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-1D單人單面凈化工作臺(tái)：蘇凈凈化設(shè)備有限公司；PHSJ-4A實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；MJX-250B-Z培養(yǎng)箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 液體富集培養(yǎng)[3]

將配制好的液體培養(yǎng)基分裝于試管，每支試管9mL，塞上棉花塞，用牛皮紙包扎，于0.15MPa蒸汽壓力條件下滅菌30min，冷卻備用。

在無(wú)菌操作下，取已經(jīng)產(chǎn)生絮狀物的食醋1mL，不調(diào)pH直接接入液體培養(yǎng)基[4]，置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。

1.3.2 平板涂布培養(yǎng)

平板制備：準(zhǔn)確稱取除無(wú)水乙醇外的其他培養(yǎng)基組分，配制后在0.15MPa蒸汽壓力條件下滅菌30min，待培養(yǎng)基冷卻至45℃左右[5]，于無(wú)菌操作下加入無(wú)水乙醇，搖勻，傾倒平板，培養(yǎng)基凝固后備用。

涂布培養(yǎng)：在無(wú)菌操作下，將富集培養(yǎng)的菌液用滅過(guò)菌的生理鹽水，按照100、101、102的梯度進(jìn)行稀釋，分別取0.2mL梯度稀釋的菌液至平板[6]，用涂布棒均勻涂布后置于30℃恒溫箱中培養(yǎng)4～7d。

1.3.3 平板劃線培養(yǎng)

平板制備：方法同1.3.2。

劃線培養(yǎng)：在無(wú)菌操作下，用接種環(huán)分別挑取涂布培養(yǎng)形成的單一菌落進(jìn)行平板劃線，然后置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～7d。

1.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn)[7]

挑取劃線培養(yǎng)的純菌落再接入滅菌后的液體培養(yǎng)基中，于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，觀察是否有絮狀物產(chǎn)生，從而篩選出目標(biāo)菌。

1.3.5 初步鑒定

針對(duì)目標(biāo)菌，根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[8]和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[9]進(jìn)行初步鑒定。

1.3.6 檢測(cè)方法優(yōu)化

對(duì)葡萄糖、pH值及培養(yǎng)溫度3個(gè)因子進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)[10]，找出食醋絮狀物產(chǎn)生菌的最佳檢測(cè)方法。

2 結(jié)果與討論

2.1 微生物的分離純化

通過(guò)液體富集培養(yǎng)、平板涂布及劃線培養(yǎng)，從產(chǎn)生絮狀物的食醋中得到A、B、C 3種微生物，其菌落形態(tài)見(jiàn)圖1。

圖1 分離出的三種微生物菌落形態(tài)圖Fig.1 Colonial morphology of three kinds of microbes isolated from vinegar

2.2 驗(yàn)證結(jié)果

將A、B、C 3株菌分別接入滅菌后的液體培養(yǎng)基中，每組各接3支試管，于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。C菌株在接種48h后3支試管均產(chǎn)生絮狀物，A菌株和B菌株培養(yǎng)96h后仍無(wú)絮狀物產(chǎn)生，因此確定C菌株為食醋中產(chǎn)生絮狀物的目標(biāo)菌。

2.3 目標(biāo)菌初步鑒定結(jié)果

對(duì)平板劃線培養(yǎng)的目標(biāo)菌進(jìn)行鑒定，其菌落小而突起，蒼白色，邊緣規(guī)則、整齊，光滑、濕潤(rùn)，易于挑取；鏡檢菌體呈桿狀，單個(gè)、成對(duì)或成鏈；對(duì)照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，結(jié)果見(jiàn)表1，初步鑒定該菌為葡糖桿菌屬（Gluconobacter）。可氧化乙醇得乙酸，但由于細(xì)胞中缺少琥珀酸脫氫酶，沒(méi)有完整的三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA）途徑，因而不能將乙酸或乙酸鹽進(jìn)一步氧化成CO2和H2O[11]。能通過(guò)己糖-磷酸鹽途徑分解代謝D-葡萄糖，并從D-葡萄糖產(chǎn)生2-酮基葡萄糖酸和5-酮基葡萄糖酸[12]。

2.4 檢測(cè)參數(shù)確定

為了縮短檢出食醋成品中是否存在絮狀物產(chǎn)生菌的時(shí)間，更好地指導(dǎo)生產(chǎn)，防止問(wèn)題產(chǎn)品出廠，有必要對(duì)該菌的檢測(cè)方法進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)在液體富集培養(yǎng)及單因素預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定葡萄糖、pH值及培養(yǎng)溫度3個(gè)因子，每個(gè)因子選擇3個(gè)水平，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，并根據(jù)液體培養(yǎng)基中絮狀物產(chǎn)生的時(shí)間進(jìn)行記錄。因子水平表見(jiàn)表2，試驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表2、表3。

表1 絮狀物產(chǎn)生菌初步鑒定結(jié)果Table 1 Preliminary identification results of floccules strains

表2 絮狀物產(chǎn)生菌檢測(cè)條件優(yōu)化正交因素與水平Table 2 Factor and levels of orthogonal experiment for optimization of floccules strains detection conditions

表3 絮狀物產(chǎn)生菌檢測(cè)條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Result and analysis of orthogonal experiment for optimization of floccules strains detection conditions

由表3所得極差R可知，對(duì)絮狀物產(chǎn)生菌檢測(cè)結(jié)果的影響依次為：葡萄糖＞培養(yǎng)溫度＞pH值；由表4可知，因子A影響極顯著，因子C影響顯著，因子B影響不顯著，因此，確定食醋中絮狀物產(chǎn)生菌檢測(cè)方法各因子的最佳水平為A3B3C2，即葡萄糖3g/100mL，pH值6.0，培養(yǎng)溫度28℃。

表4 絮狀物產(chǎn)生菌檢測(cè)條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiment for optimization of floccules strains detection conditions

2.5 檢測(cè)方法驗(yàn)證及確定

按照2.4中確定的參數(shù)配制馬鈴薯液體培養(yǎng)基，分裝于試管，每支試管9mL，塞上棉花塞，用牛皮紙包扎，于0.15MPa蒸汽壓力條件下滅菌30min，冷卻備用。

在無(wú)菌操作下，取上述試管4支，其中3支接入有絮狀物的食醋，余下1支作為空白對(duì)照，接種后置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察結(jié)果（圖2）：接有絮狀物食醋的3支試管均在24h內(nèi)產(chǎn)生絮狀物；48h后絮狀物在液體培養(yǎng)基表面聚集形成凝膠膜[13]，當(dāng)膜達(dá)到一定厚度便開(kāi)始下沉，絮狀物繼續(xù)聚集然后在液體表面產(chǎn)生新的凝膠膜；空白對(duì)照無(wú)絮狀物、凝膠膜產(chǎn)生。由此確定食醋絮狀物產(chǎn)生菌的檢測(cè)方法如下：

圖2 24h、48h絮狀物和空白對(duì)比Fig.2 Comparison of floccules and blank after 24 h and 48 h

2.5.1 馬鈴薯液體培養(yǎng)基

馬鈴薯汁1 000mL，葡萄糖20g，pH值6.0；

馬鈴薯汁制備方法：稱取去皮、切塊的土豆200g，加入1 000mL蒸餾水，煮沸20～30min，用多層紗布過(guò)濾，濾液加水定容至1 000mL。

2.5.2 分裝、滅菌

每支試管裝入9mL馬鈴薯液體培養(yǎng)基，塞上棉花塞，用牛皮紙包扎，于0.15MPa蒸汽壓力條件下滅菌30min，冷卻備用。

2.5.3 接種培養(yǎng)

在無(wú)菌操作下，取食醋1mL不調(diào)pH，直接接入試管液體培養(yǎng)基中，搖勻，塞上棉花塞，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每組待測(cè)樣至少做3支試管，同時(shí)做空白對(duì)照。

2.5.4 結(jié)果判定

24h內(nèi)，每組待測(cè)樣只要1支試管有絮狀物產(chǎn)生，而對(duì)照組無(wú)此現(xiàn)象，即可判定不合格；若待測(cè)樣的每支試管均無(wú)絮狀物產(chǎn)生，則繼續(xù)培養(yǎng)72h，每支試管均無(wú)絮狀物產(chǎn)生方可判定合格。

3 結(jié)論

從食醋中分離到的絮狀物產(chǎn)生菌為葡糖桿菌屬，其是醋酸菌科（Acetobacteraceae）的一個(gè)重要屬，與醋桿菌屬和葡糖酸桿菌菌屬菌株大多生長(zhǎng)在富醇的培養(yǎng)基不同，葡糖醋桿菌屬菌株一般生長(zhǎng)在含糖豐富的環(huán)境中[14]，可出現(xiàn)在花、園土、啤酒酵母、果實(shí)、葡萄酒、蘋果酒、啤酒、南非班圖酒、酒醋、軟飲料等[15]。采用馬鈴薯液體培養(yǎng)基，在葡萄糖3g/100mL，pH值6.0的條件下，于28℃培養(yǎng)最快可在24h內(nèi)檢出，有利于指導(dǎo)生產(chǎn)，預(yù)防食醋尤其袋裝食醋貨架期出現(xiàn)絮狀物影響產(chǎn)品品質(zhì)。

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