產(chǎn)淀粉酶非釀酒酵母菌的篩選及產(chǎn)酶特性研究

徐亞男，劉秋萍，王 月，趙九洲，肖 婧，史學(xué)偉*

（石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子 832000）

淀粉酶是一類能夠催化α-D-吡喃葡糖基之間1-4糖苷鍵水解的酶類[1]，廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物有機(jī)體中，作用于淀粉分子產(chǎn)生多種產(chǎn)物，包括糊精、低聚糖及單糖分子等。淀粉酶作為一種生物催化劑，與傳統(tǒng)的化學(xué)催化劑相比具有催化能力強(qiáng)、底物專一性高等優(yōu)點(diǎn)[2]，已在各個(gè)行業(yè)中得到廣泛應(yīng)用。在淀粉加工行業(yè)中，用酶法糖化制造葡萄糖，使糖純度高、收得率高[3]；用淀粉酶液化和麥芽糖化法制麥芽糖，節(jié)約糧食，提高得糖率；α-淀粉酶制造低聚異麥芽糖，不產(chǎn)生界限糊精，有利于過(guò)濾[4]；α-淀粉酶可將淀粉長(zhǎng)鏈分子水解為短鏈分子[1]，制造淀粉黏合劑，可增大其固體含量，控制淀粉的黏度以適應(yīng)紙箱行業(yè)的需要；在紡織工業(yè)中，通常采用分批浸入式和連續(xù)式的α-淀粉酶去漿；在臨床醫(yī)學(xué)分析和制藥工業(yè)上，耐酸性強(qiáng)的α-淀粉酶可作為助消化劑添加于消化藥中[5]；在面包制作中淀粉酶用于改善面包的質(zhì)量風(fēng)味、縮短發(fā)酵時(shí)間、節(jié)約用糖[6]；此外還廣泛用于造紙業(yè)和清潔劑工業(yè)等。鑒于淀粉酶是用途最廣和產(chǎn)量最大的酶這一現(xiàn)狀，選育出酶產(chǎn)量高且具有良好性能的淀粉酶產(chǎn)生菌有著重要的應(yīng)用價(jià)值。

非釀酒酵母菌是一類自然存在于葡萄表皮、釀酒環(huán)境中，能分泌多種胞外酶，通過(guò)代謝和自溶提高發(fā)酵食品的感官特性，參與復(fù)雜風(fēng)味物質(zhì)形成的酵母菌[7]。本研究的目的是在新疆特色葡萄、蘋(píng)果及奶酪產(chǎn)品中，廣泛采集非釀酒酵母菌，以期從中找到產(chǎn)淀粉酶活性較高的菌株。通過(guò)對(duì)產(chǎn)淀粉酶菌株進(jìn)行鑒定，對(duì)所產(chǎn)淀粉酶的性質(zhì)進(jìn)行初步研究，應(yīng)用于新疆特色釀造發(fā)酵行業(yè)中，以期改善產(chǎn)品質(zhì)量，為后期的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)菌株

樣品采自新疆蘋(píng)果園腐爛蘋(píng)果、新疆維吾爾族人自制奶酪、新疆葡萄產(chǎn)區(qū)葡萄表皮及土壤，分離純化、鑒定后選取生長(zhǎng)力較好的非釀酒酵母菌株為試驗(yàn)菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基[8]

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基：葡萄糖2.0%，酵母提取物2.0%，蛋白胨2.0%，瓊脂2.0%，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

酵母膏胨葡萄糖（yeast peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：葡萄糖2.0%，酵母提取物2.0%，蛋白胨2.0%，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

篩選培養(yǎng)基：酵母膏0.5%，蛋白胨1.0%，NaCl 1.0%，可溶性淀粉0.2%，瓊脂2.0%，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基：酵母膏0.5%，蛋白胨1.0%，NaCl 1.0%，可溶性淀粉0.2%，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母膏0.2%，蛋白胨0.8%，可溶性淀粉1.2%，MgSO4·7H2O 0.05%，K2HPO40.1%，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

試驗(yàn)所用試劑及藥品均為分析純：新疆沃德生物公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ES120型精密天平：上海力衡儀器儀表有限公司；SW-CJ-2D型超凈臺(tái)：上海尚道儀器設(shè)備有限公司；DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海申賢恒溫設(shè)備廠；BHWY-211型變頻恒溫?fù)u床：常州諾基儀器有限公司；TGL-16型臺(tái)式高速離心機(jī)：金壇市城西麗華實(shí)驗(yàn)儀器廠；W-201B型數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市國(guó)旺實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 菌株分離純化

樣品經(jīng)破碎帶皮進(jìn)行自然發(fā)酵，發(fā)酵啟動(dòng)后以不同濃度梯度涂布于YPD培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)48 h后，多次分離劃線得到單菌落，接種于YEPD培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)48 h后，甘油保存于-80 ℃冰箱。蘋(píng)果樣品編號(hào)為Ai，奶酪樣品編號(hào)為Nj，葡萄樣品編號(hào)為Yz。

1.3.2 26S rDNA基因PCR擴(kuò)增

根據(jù)形態(tài)學(xué)特征選取生長(zhǎng)力較好且具有代表性的菌株按陳杰等[9]的方法進(jìn)行DNA提取及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序。

1.3.3 產(chǎn)酶菌株的篩選

菌懸液于37 ℃涂布于篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后加稀碘液，靜置5 min后即可見(jiàn)清晰的透明圈[10]，測(cè)量透明圈與菌落直徑選取較大的單菌落接種于種子培養(yǎng)基，搖床37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，5%接種量于發(fā)酵培養(yǎng)基，搖床37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h。

1.3.4 粗酶液的制備

取發(fā)酵液于4 ℃、5 000 r/min 條件下離心5 min，上清液即為粗酶液。

1.3.5 淀粉酶活性測(cè)定

取離心后的發(fā)酵液0.2 mL與1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的淀粉溶液于37 ℃水浴5 min后沸水浴5 min終止反應(yīng)，加入1 mL 3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS），沸水浴5 min后迅速冷卻，10 mL定容，于波長(zhǎng)540 nm處測(cè)定其吸光度值。以煮沸1%淀粉溶液為空白。酶活力單位定義[11]：在37 ℃，每分鐘生成1 μmol/L葡萄糖所用酶量為1個(gè)酶活單位（U）。酶活力計(jì)算公式如下：

式中：A為根據(jù)回歸方程計(jì)算得葡萄糖含量，mg；N為稀釋倍數(shù)；t為反應(yīng)時(shí)間，min。

1.3.6 粗酶性質(zhì)研究

（1）pH值對(duì)酶活的影響[12]

分別配制0.1 mol/L Na2HPO4-檸檬酸緩沖溶液（pH 3.0～5.0）、醋酸緩沖溶液（pH 4.0～7.0）、Tris-HCl緩沖溶液（pH 6.0～9.0）、甘氨酸-NaOH緩沖溶液（pH 8.0～10.0），配制1%淀粉溶液作為酶活測(cè)定的反應(yīng)底物，考察pH值對(duì)酶活的影響。

（2）pH穩(wěn)定性研究

粗酶液分別與等量不同pH緩沖液混勻，置于4 ℃冰箱12 h后，調(diào)至最適pH測(cè)酶活，以最高酶活為100%，其他pH條件下為相對(duì)酶活，考察酶pH穩(wěn)定性。

（3）溫度對(duì)酶活的影響[13]

控制水浴溫度，每10 ℃為一個(gè)梯度，溫度分別為30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃[13]，水浴5 min后，測(cè)酶活，以確定最適反應(yīng)溫度，考察溫度對(duì)酶活的影響。

（4）熱穩(wěn)定性研究

粗酶液置于不同溫度水浴，30 min后迅速冷卻，測(cè)酶活，以最高酶活為100%，其他溫度條件下為相對(duì)酶活，考察酶的熱穩(wěn)定性。

（5）金屬離子、抑制劑、螯合劑對(duì)酶活的影響[14]

反應(yīng)體系中加1 mmol/L各種金屬離子溶液1 mL：Ca2+、Mg2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+；抑制劑十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）；螯合劑乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA），測(cè)酶活，以最高酶活為100%，其他金屬離子及抑制劑、螯合劑下為相對(duì)酶活，考察金屬離子、抑制劑、螯合劑對(duì)酶活的影響。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

獨(dú)立重復(fù)進(jìn)行3次試驗(yàn)，結(jié)果表示3次測(cè)定的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于26S rDNA基因序列的酵母菌株系統(tǒng)發(fā)育分析

樣品菌株經(jīng)分離純化后根據(jù)形態(tài)學(xué)特征，選取37株非釀酒酵母菌進(jìn)行DNA提取及26S rDNA基因PCR擴(kuò)增，所得序列提交NCBI，通過(guò)Blast工具在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中與已發(fā)表的26S rDNA D1/D2區(qū)域序列進(jìn)行同源性比較，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2 產(chǎn)酶菌株的篩選

將稀碘液滴入篩選培養(yǎng)基，觀察顏色變化和水解圈，篩選出11株產(chǎn)淀粉酶菌株。產(chǎn)酶菌株分別為A1、A2、A4、A5、N1、N8、N11、Y13、Y15、Y18、Y19。篩選結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可知，A2、A5、N11、Y13的水解圈的直徑與菌落直徑的比值較大，該比值與液體發(fā)酵產(chǎn)酶能力的高低并不成正比關(guān)系。因菌落周圍降解圈的大小除了與酶的活性有關(guān)外，還與菌株自身及酶所需的條件有關(guān)。因此，還需對(duì)酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究，以篩選出高產(chǎn)淀粉酶菌株。

圖1 基于26S rDNA序列的37株酵母菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of the 37 yeast strains based on 26S rDNA sequence

圖2 產(chǎn)酶菌株篩選結(jié)果Fig.2 Screening results of enzyme production

2.3 粗酶性質(zhì)試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 pH值對(duì)淀粉酶酶活性的影響

圖3 pH值對(duì)淀粉酶活性的影響Fig.3 Effect of pH on amylase activity

酶需要在一定的pH值、溫度和金屬離子存在下才能發(fā)揮作用。pH值影響酶的空間結(jié)構(gòu)、底物與酶的結(jié)合、酶活性部位的構(gòu)象，進(jìn)而引起酶的構(gòu)象改變，使結(jié)合后不能生成產(chǎn)物，影響酶的活性[15]。由圖3可知，在酶活定義37 ℃下測(cè)定酶活，隨著pH值的升高，各菌株淀粉酶酶活力增大，在pH 7.0～8.0時(shí)達(dá)到最高（Y19除外），pH繼續(xù)增加，則酶活力降低較大幅度。其中，Y19在pH值為9.0時(shí)酶活力達(dá)到最高，呈堿性。菌株A1、A2、A4、A5、Y13、Y15、Y18最適pH值為8.0，呈弱堿性；菌株N1、N8、N11最適pH值為7.0，呈中性。

2.3.2 pH值穩(wěn)定性研究

圖4 淀粉酶的pH穩(wěn)定性Fig.4 pH stability of amylase

不同的pH值會(huì)對(duì)酶的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。通過(guò)對(duì)酶的pH值穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)定，可以找到能夠使酶保持相對(duì)穩(wěn)定的pH值條件，以使酶達(dá)到最大酶活限度的充分利用，從而對(duì)酶進(jìn)行貯藏或生產(chǎn)[16]。由圖4可知，各菌株在pH值為6.0時(shí)，酶活力均為最佳（Y15除外），在pH值為5.0時(shí)，Y15酶活力最佳。在pH 4.0～8.0范圍內(nèi)，各菌株均可保持較好酶活力，在強(qiáng)酸pH值為3.0、強(qiáng)堿pH值為10.0時(shí)，酶活損失較嚴(yán)重，說(shuō)明菌株不耐強(qiáng)酸強(qiáng)堿。在pH及其穩(wěn)定性試驗(yàn)中，N1菌株的產(chǎn)淀粉酶的酶活力最高，其他10株則相差不大。

2.3.3 溫度對(duì)淀粉酶活性的影響

酶促反應(yīng)受溫度的影響：一方面，當(dāng)溫度升高時(shí)，反應(yīng)速率加快；另一方面，隨溫度的升高，酶蛋白變性逐漸失活，反應(yīng)速率下降[17]。由圖5可知，在各菌株最適pH值作用下，隨著溫度的升高，各菌株的酶活力增大，在40 ℃時(shí)，各菌株均表現(xiàn)了最佳酶活力，隨著溫度繼續(xù)升高，酶活力降低。由此可以判定，40 ℃為該菌株所產(chǎn)淀粉酶的最適溫度。在此試驗(yàn)中，Y13酶活力最高，略高于N1。其他菌株也表現(xiàn)出較小的差異。

圖5 溫度對(duì)淀粉酶活性的影響Fig.5 Effect of temperature on amylase activity

2.3.4 熱穩(wěn)定性研究

圖6 淀粉酶的熱穩(wěn)定性Fig.6 Thermal stability of amylase

熱穩(wěn)定性是酶的重要屬性之一[18]，任何導(dǎo)致酶的空間結(jié)構(gòu)變化的因素都會(huì)影響酶的熱穩(wěn)定性。由圖6可知，在40 ℃時(shí)，各菌株均表現(xiàn)了最佳酶活力，在30～50 ℃時(shí)，各菌株保持了較高的酶活力。A5菌株在20 ℃和60 ℃時(shí)，酶活力損失較為嚴(yán)重，損失率分別為為88%和76%。

2.3.5 金屬離子、抑制劑、螯合劑對(duì)淀粉酶活性的影響

圖7 金屬離子、抑制劑、螯合劑對(duì)酶活力的影響Fig.7 Effect of metal ions,EDTA and SDS on amylase activity

在各菌株最適pH值、溫度條件下測(cè)酶活結(jié)果（圖7）可知，F(xiàn)e2+和Cu2+對(duì)各菌株均有較高的激活作用，F(xiàn)e2+的激活作用最大（Y18除外），Mg2+對(duì)Y18有較好的激活作用，其他幾種金屬離子均對(duì)淀粉酶有不同程度的抑制作用，SDS和EDTA均能抑制酶的活性，說(shuō)明該酶的作用需要金屬離子的參與。

3 結(jié)論

在新疆葡萄產(chǎn)區(qū)葡萄表皮及土壤、腐爛蘋(píng)果及奶酪產(chǎn)品中廣泛采集樣品，分離出大量非釀酒酵母菌，對(duì)其中37株非釀酒酵母菌進(jìn)行篩選，經(jīng)過(guò)選擇性培養(yǎng)基，成功篩選出11株產(chǎn)淀粉酶酵母菌，酶學(xué)性質(zhì)研究表明，該11株酵母菌在pH 7～9表現(xiàn)了較高的酶活力，在pH 5～6時(shí)保持穩(wěn)定；最適反應(yīng)溫度為40 ℃，在30～50 ℃時(shí)保持較高酶活力；金屬離子依賴性發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e2+、Mg2+對(duì)酶有不同程度的激活作用，Ca2+、Ba2+、Cu2+對(duì)酶有抑制作用。SDS、EDTA對(duì)酶均有抑制作用，由于EDTA為金屬螯合劑，抑制酶活約為50%，可以推測(cè)，本試驗(yàn)中酶對(duì)二價(jià)金屬離子具有一定的依賴作用。

在本試驗(yàn)中，N1和Y13表現(xiàn)出較高的酶活力，N1采自奶酪，Y13采自新疆葡萄園區(qū)，蘋(píng)果樣品中產(chǎn)酶量相對(duì)較少。后期將針對(duì)高產(chǎn)淀粉酶菌株進(jìn)行誘變及分離純化，對(duì)純酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)的研究。

目前新疆葡萄酒釀造主要以進(jìn)口釀酒酵母為主，缺乏地域特色。后期研究工作的重點(diǎn)是將本試驗(yàn)篩選高產(chǎn)淀粉酶誘變菌株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)制備活性干酵母，與工業(yè)釀酒酵母混合發(fā)酵釀造葡萄酒，以期改善葡萄酒香氣、提高產(chǎn)品質(zhì)量及設(shè)備利用率，同時(shí)利用新疆葡萄酒地域優(yōu)勢(shì)[19]，提高產(chǎn)品競(jìng)爭(zhēng)力。

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