液化法釀造燕麥黃酒工藝條件優(yōu)化

劉 浩，任貴興*

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物科學(xué)研究所，北京 100081）

燕麥（Avena sativaL.）又名莜麥，為禾本科（Gram-ineae）、早熟禾亞科（Pooideae）、燕麥屬（Avena），一年生草本植物，是古老的飼草、飼料及糧食作物[1-2]。按照外稃的性狀可分為有稃型的皮燕麥與無稃型的裸燕麥兩類，我國以種植裸燕麥為主。燕麥籽粒食用為主，通常認為裸燕麥的營養(yǎng)價值比皮燕麥更高[3]。燕麥?zhǔn)菭I養(yǎng)與醫(yī)療保健價值較高的谷物，蛋白質(zhì)含量很高，富含可溶性膳食纖維、β-葡聚糖、酚酸、蒽酰胺（avenanthramides）、類黃酮、維生素E等化合物[4]。如此豐富的營養(yǎng)與功能成分使得燕麥及其制品有多種生物活性，如降血脂[5]、降血糖[6]、抗氧化[7]、免疫增強[8]等。燕麥?zhǔn)秤眉庸v史悠久，主要是以燕麥谷物早餐等形式出現(xiàn)[1]。在我國，大部分燕麥用于制粉，進而制作燕麥傳統(tǒng)食品（如莜面、栲栳栳）、燕麥面包與餅干[9]等。近年來含有或使用燕麥作為主要原料制作的谷物飲料、豆?jié){、酸奶等飲品也有出現(xiàn)[10-12]。

黃酒釀造歷史悠久，傳統(tǒng)釀造工藝歷經(jīng)幾千年的不斷改進和完善已達到很高的水平，但仍然存在生產(chǎn)周期長、原料利用率不高、人工勞動強度大等缺點。黃酒釀造新工藝在傳統(tǒng)工藝的基礎(chǔ)上進行改進。液化法是黃酒釀造新工藝的其中一種，基本過程是將原料粉碎后使用酶制劑和微生物進行液化、糖化、發(fā)酵，該工藝對于原料的選擇范圍更廣、利用率更高，此外還具有醪液流動性可控、易于機械化生產(chǎn)等優(yōu)點[13-14]。液化法用于雜糧酒釀造已有相關(guān)報道，如苦蕎酒[15]、薏米酒[16]、紫薯酒[17]等。

本研究以炒制并磨碎的裸燕麥為原料，以葡萄糖當(dāng)量值、還原糖含量、固形物含量等作為綜合評價指標(biāo)，通過單因素試驗與正交試驗對液化法釀造燕麥黃酒的液化、糖化、主發(fā)酵工藝條件進行優(yōu)化，旨在為燕麥黃酒的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

裸燕麥：取自河北省張家口市農(nóng)業(yè)科學(xué)院；耐高溫α-淀粉酶（40 000 U/g）、糖化酶（100 000 U/g）均為食品級：江蘇瑞陽生物科技有限公司；黃酒活性干酵母、甜酒曲：安琪酵母股份有限公司；氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉均為分析純：西隴化工股份有限公司；3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）、無水亞硫酸鈉（分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；重蒸酚、葡萄糖（分析純）：上海Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GTJ-368滾筒式電加熱炒貨機：青島德維機械制造有限公司；WK-400A試驗室小型高速粉碎機：山東青州精誠機械有限公司；PB602電子天平（感量0.01 g）、PB203電子天平（感量0.001 g）：METTLER TOLEDO集團；3FG-01B電熱恒溫干燥箱：湖北省黃石市醫(yī)療器械廠；TD25-WS多管架自動平衡離心機：湘儀離心機儀器有限公司；4802UV/VIS分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；RP-300B人工氣候箱：中國南京恒裕電子儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 分析方法

還原糖的測定采用DNS法[18]：待測液4 500 r/min離心5 min，取上清液稀釋至適宜倍數(shù)待測；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備，配制不同葡萄糖含量的反應(yīng)液，再加入3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑3.5 mL，輕搖混勻，沸水浴10 min顯色，冷卻后用純凈水定容至20 mL，顛倒混勻。在波長540 nm處比色，以去離子水為空白，測出各管的吸光度值。以吸光度值為縱坐標(biāo)，葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程，計算還原糖含量。

固形物含量的測定參照GB/T 13662—2008《黃酒》中總固形物的測定方法執(zhí)行，略有改動。吸取稀釋至合適倍數(shù)的試樣5 mL于已知干燥至質(zhì)量恒定的蒸發(fā)皿中，放入（103±2）℃的電熱干燥箱中烘干4 h，取出稱質(zhì)量（g），按照下式計算固形物含量。

葡萄糖當(dāng)量值（dextrose equivalent，DE）值[19]的計算公式：

酒精度、非糖固形物、總糖、總酸、氨基酸態(tài)氮、pH值、氧化鈣、β-苯乙醇、鉛、微生物含量的測定均按照GB/T 13662—2008《黃酒》中的測定方法執(zhí)行。

1.3.2 傳統(tǒng)方法與液化方法釀造燕麥黃酒對比試驗設(shè)計

分別采用北方黃酒傳統(tǒng)釀造工藝與液化工藝進行初步試驗，選取籽粒飽滿、無霉變、無蟲蛀的燕麥，除去雜質(zhì)，潤麥調(diào)節(jié)水分至25%，平衡12 h。在200～220 ℃炒制20 min，冷卻干燥12 h。粉碎機粉碎過40目標(biāo)準(zhǔn)篩，備用。

傳統(tǒng)工藝：

炒制燕麥米→浸米12 h→蒸煮→接種→30 ℃前酵→16 ℃后酵→壓榨→酒樣

液化工藝：

炒制燕麥米→粉碎→加水混勻→耐高溫α-淀粉酶液化→糖化酶糖化→接種→30 ℃前酵→16 ℃后酵→壓榨→酒樣。

兩種釀造方法的加水量一致，前發(fā)酵每隔12 h 測定一次相對失質(zhì)量（測定前充分攪拌醪液使氣體散出，相對失質(zhì)量為醪液初始質(zhì)量減去時間節(jié)點時的測定質(zhì)量），并測定壓榨后酒樣的酒精度、總糖含量與固形物含量。

1.3.3 燕麥黃酒液化與糖化工藝優(yōu)化試驗設(shè)計

液化醪液的DE值控制一般在15%～20%[19-20]。液化DE值低，料液易老化、黏度大、難于操作，也不利于糖化；液化程度過高不利于糖化過程酶與底物形成絡(luò)合結(jié)構(gòu)，影響催化效率。

液化時間對液化程度的影響，分別稱取經(jīng)過預(yù)處理的燕麥粉，料水比1∶3.5混勻，依照酶活與燕麥粉質(zhì)量之比5 U/g的量加入耐高溫α-淀粉酶，混勻后升溫至95 ℃分別液化10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，稀釋后4 500 r/min離心取上清液，測定還原糖含量與固形物含量，計算DE值。耐高溫α-淀粉酶添加量對液化程度的影響試驗，酶活與燕麥粉質(zhì)量之比分別為3 U/g、4 U/g、5 U/g、6 U/g、8 U/g、10 U/g。液化溫度對液化程度的影響試驗，溫度分別為80 ℃、85 ℃、90 ℃、95 ℃、100 ℃。

根據(jù)單因素試驗所得結(jié)果選擇合適的水平范圍，使用L9（34）正交表，以DE值為指標(biāo)設(shè)計3因素3水平的正交試驗確定最優(yōu)條件組合。

1.3.4 燕麥黃酒糖化工藝優(yōu)化試驗設(shè)計

時間對糖化效果的影響：依照酶活與燕麥粉質(zhì)量之比80 U/g的量加入糖化酶，混勻，60 ℃分別糖化30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min、210 min、240 min，稀釋后4 500 r/min離心取上清液，測定還原糖含量與固形物含量，計算DE值。糖化酶添加量對糖化效果的影響：酶活與燕麥粉質(zhì)量之比分別按50 U/g、60 U/g、70 U/g、80 U/g、90 U/g、100 U/g、110 U/g的量加入糖化酶。溫度對糖化效果的影響：溫度分別為40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃、75 ℃。正交試驗設(shè)計同液化工藝優(yōu)化。

1.3.5 燕麥黃酒主發(fā)酵工藝優(yōu)化試驗設(shè)計

據(jù)相關(guān)文獻報道，主發(fā)酵時間多集中于3 d[15-17]，本試驗適當(dāng)延長發(fā)酵時間至5 d，以消耗更多的糖分并促進香氣成分的產(chǎn)生。

調(diào)整燕麥粉與水的質(zhì)量之比1∶2.5、1∶3.0、1∶3.5、1∶4.0、1∶4.5，接種酵母量為燕麥粉質(zhì)量的0.15%，30 ℃分別發(fā)酵5 d，醪液4 500 r/min離心取上清液，測定酒精度。酵母接種量對主發(fā)酵結(jié)果的影響：接種酵母量為燕麥粉質(zhì)量的0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%。溫度對主發(fā)酵結(jié)果的影響：發(fā)酵溫度為25 ℃、27 ℃、30 ℃、33 ℃、35 ℃。在單因素試驗基礎(chǔ)上，使用L9（34）正交表，以酒精度為指標(biāo)設(shè)計正交試驗確定最優(yōu)條件組合。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理方法

測定試驗均重復(fù)兩次，結(jié)果為平均值的方式表示。使用OEA3.1軟件進行正交試驗設(shè)計，SAS 9.1進行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 傳統(tǒng)方法與液化方法釀造燕麥黃酒對比試驗

圖1 傳統(tǒng)方法與液化方法的發(fā)酵曲線Fig.1 Fermentation curves of traditional method and liquefaction method

前發(fā)酵過程中醪液的相對失質(zhì)量測定結(jié)果見圖1，醪液的相對失質(zhì)量能表征發(fā)酵的速度與最終原料利用率。由圖1可以看出，液化法起初的發(fā)酵速度較慢，這可能是因為前處理過程中淀粉糖化、液化程度較高，使得醪液糖度較高，對發(fā)酵母增殖起到抑制作用。但抑制作用解除后，液化發(fā)酵速率明顯加快（圖1中段），且高于傳統(tǒng)方法。從終點的相對失質(zhì)量來看，液化法釀造對原料的利用率要比傳統(tǒng)方法高。同時對兩種方法得到的酒樣測定結(jié)果表明，液化法酒樣的酒精度（12.6±0.1）%vol與總固形物（52.8±2.0）g/L含量明顯高于傳統(tǒng)方法（11.1±0.3）%vol，（47.0±0.8）g/L，但液化法酒樣總糖含量（19.6±0.3）g/L卻低于傳統(tǒng)方法（23.7±0.4）g/L，這說明液化法釀造黃酒有更高的原料利用率。

2.2 液化法釀造燕麥黃酒最佳液化工藝條件的確定

2.2.1 液化時間對液化程度的影響

液化時間對液化程度的影響結(jié)果見圖2。由圖2可知，液化開始時首先是淀粉酶分解直鏈淀粉產(chǎn)生寡糖，此酶促反應(yīng)速度較快。而后淀粉酶作用于支鏈淀粉，同時使得部分寡糖水解，但此時酶解產(chǎn)物的積累與1,6-糖苷鍵相對比例的增大會使得酶促反應(yīng)速度下降[21]。由圖2可以看出，還原糖含量的增加速度比干物質(zhì)含量增加的速度要快，30 min時DE值達到最大，但是此時的還原糖含量卻沒有達到最大值。而當(dāng)40 min以后DE值雖稍有降低，但還原糖的含量平穩(wěn)，干物質(zhì)量略有升高。因此選擇30～50 min作為較優(yōu)液化時間。

圖2 液化時間對液化程度的影響Fig.2 Effect of time on liquefaction degree

2.2.2 耐高溫α-淀粉酶添加量對液化程度的影響

耐高溫α-淀粉酶添加量對液化程度的影響結(jié)果見圖3。由圖3可知，在酶促反應(yīng)中，底物濃度足夠高時，酶促反應(yīng)速度隨著酶添加量的增加而提高[22]。由圖3可知，隨著酶添加量的增大，還原糖與干物質(zhì)含量均有升高。當(dāng)液化醪液化程度（DE值）控制在15%～20%時，利于后續(xù)液化與發(fā)酵。酶添加量＞5 U/g時，DE值上升過快，不利于生產(chǎn)控制。因此選擇3～5 U/g作為較優(yōu)淀粉酶添加量。

圖3 耐高溫α-淀粉酶酶添加量對液化程度的影響Fig.3 Effect of thermostable α-amylase addition on liquefaction degree

2.2.3 液化溫度對液化程度的影響

液化溫度對液化程度的影響見圖4。由圖4可知，在一定溫度內(nèi)，酶促反應(yīng)速度隨溫度的升高而增快，至最適反應(yīng)溫度后，繼續(xù)升高溫度會造成部分酶的失活，使反應(yīng)速度下降[22]。由圖4可知，在溫度＞95 ℃后還原糖含量有所降低；但干物質(zhì)含量隨著溫度的升高而增大；在95 ℃時DE值最高，因此得到最適液化溫度為90～100 ℃。

圖4 溫度對液化程度的影響Fig.4 Effect of temperature on liquefaction degree

2.2.4 液化條件正交試驗優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗所得結(jié)果選擇合適的水平范圍，使用L9（34）正交表，以DE值為指標(biāo)設(shè)計正交試驗確定最優(yōu)液化條件組合。其試驗設(shè)計與結(jié)果見表1，方差分析見表2。

表1 液化條件優(yōu)化正交試驗設(shè)計與結(jié)果Table 1 Design and results of orthogonal test for liquefaction conditions optimization

由表1與表2可以看出，液化條件對于液化程度的影響均顯著（P＜0.05），主次順序為酶添加量＞溫度＞時間。由正交試驗得到的最佳組合為A2B3C2。即液化溫度95 ℃、液化酶添加量5 U/g、液化時間40 min，在此條件下進行驗證試驗，DE值為21.96%。

表2 液化正交試驗結(jié)果方差分析Table 2 Variance analysis of liquefaction orthogonal tests results

2.3 液化法釀造燕麥黃酒最佳糖化工藝條件的確定

2.3.1 糖化時間對糖化程度的影響

糖化時間對糖化效果的影響見圖5。由圖5可知，150 min之前糖化醪的還原糖含量隨時間的推移而升高，在150 min后變化不大，趨于平緩，180 min后基本達到穩(wěn)定。DE值的變化趨勢與之類似。為保證糖化質(zhì)量，選取120～180 min作為較優(yōu)糖化時間。

圖5 糖化時間對糖化效果的影響Fig.5 Effect of time on the saccharification

2.3.2 糖化酶添加量對糖化程度的影響

圖6 糖化酶添加量對糖化效果的影響Fig.6 Effect of glucoamylase addition on the saccharification

糖化酶添加量對糖化程度的影響見圖6。由圖6可知，底物濃度足夠高時，酶促反應(yīng)速度與酶添加量存在正相關(guān)關(guān)系。糖化酶添加量為110 U/g時，與糖化酶添加量100 U/g時相比，DE值略有升高但還原糖含量沒有明顯差異，同時兼顧成本因素，確定80～100 U/g為較優(yōu)糖化酶添加量。

2.3.3 溫度對糖化程度的影響

溫度對糖化程度的影響見圖7。溫度能顯著影響酶促反應(yīng)，在適宜的溫度范圍內(nèi)，酶促反應(yīng)隨著溫度的升高加快，至最適反應(yīng)溫度時到達最快。若溫度繼續(xù)升高，會導(dǎo)致酶失活，使得酶促反應(yīng)速度降低。由圖7可知，還原糖含量、干物質(zhì)含量與DE值在溫度≤65 ℃范圍內(nèi)逐漸升高，但＞65 ℃后糖化酶失活嚴(yán)重，三個指標(biāo)均降低，均因此確定最適反應(yīng)溫度為60～70 ℃。

圖7 糖化溫度對糖化效果的影響Fig.7 Effect of temperature on saccharification

2.3.4 糖化條件優(yōu)化正交試驗

表3 糖化條件優(yōu)化正交試驗設(shè)計與結(jié)果Table 3 Design and results of orthogonal test for saccharification conditions optimization

根據(jù)單因素試驗所得結(jié)果選擇合適的水平范圍，使用L9（34）正交表，以DE值為指標(biāo)設(shè)計正交試驗確定最優(yōu)糖化條件組合。試驗設(shè)計與結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表4 糖化條件正交試驗結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of saccharification orthogonal tests results

由表3、表4可以看出，糖化條件對糖化程度均有極顯著的影響（P＜0.01），主次順序為溫度＞糖化酶添加量＞時間。由正交試驗直觀分析得到的最佳組合為A2B3C3。即溫度65 ℃，糖化酶添加量100 U/g，時間180 min，此時DE值為77.21%。

2.4 主發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗

圖8 料液比（A）、酵母接種量（B）與發(fā)酵溫度（C）對酒精度的影響Fig.8 Effect of material to water ratio(A),yeast inoculum(B) and fermentation temperature(C) on alcohol content

2.4.1 主發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗

主發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗結(jié)果見圖8。隨著料液比、酵母接種量和溫度的增加，酒精度均呈先上升后下降的趨勢。由圖8可知，料液比對醪液酒精度有明顯影響。加水量較少時，酒精度較低，是因為發(fā)酵程度不夠，原料未得到充分利用，酒精轉(zhuǎn)化效率低。加水量較多時，由于稀釋作用，酒精度也很低，因此確定最佳料液比為1∶3.5；酵母接種量對酒精度的影響極為明顯。酵母接種量較少，原料不能充分發(fā)酵；酵母接種量過大則會使得酵母繁殖過快，將部分糖用于自身生長，使酒精度偏低，因此確定最佳酵母接種量為0.25%；當(dāng)溫度較低時，酵母代謝與繁殖均會很慢。當(dāng)溫度很高時，酵母代謝與繁殖速率過快，這會導(dǎo)致酵母老化。因此確定最佳主發(fā)酵溫度為30 ℃。

2.4.2 主發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果

根據(jù)單因素試驗所得結(jié)果，以酒精度為指標(biāo)設(shè)計正交試驗確定主發(fā)酵最優(yōu)條件組合。試驗設(shè)計與結(jié)果見表5，方差分析見表6。

表5 主發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗設(shè)計與結(jié)果Table 5 Design and results of orthogonal test for main fermentation conditions optimization

表6 主發(fā)酵條件正交試驗結(jié)果方差分析Table 6 Variance analysis of main fermentation orthogonal tests result

由表5、表6可以看出，料液比、酵母接種量與發(fā)酵溫度對酒精度均影響顯著（P＜0.05），其中料液比和酵母接種量達到了極顯著水平（P＜0.01），影響大小順序為料液比＞酵母添加量＞溫度。分析得到最佳條件組合為A2B2C2，即料液比1∶3.5、酵母添加量0.25%、發(fā)酵溫度30 ℃，在此條件下進行驗證試驗，酒精度為9.2%vol，發(fā)酵結(jié)束后的殘?zhí)橇繛?0.19 mg/mL。

2.5 最佳工藝條件下燕麥黃酒釀造試驗結(jié)果

最佳釀造工藝條件下，再經(jīng)過16 ℃、30 d的后發(fā)酵，壓榨得到的燕麥黃酒呈橙黃色，清亮透明，口味醇和爽口，但有區(qū)別于普通稻米黃酒的燕麥發(fā)酵特殊香氣。具體品質(zhì)指標(biāo)測定結(jié)果及國標(biāo)范圍見表7。由表7可知，在最佳工藝條件下，黃酒酒樣分析結(jié)果符合國家標(biāo)準(zhǔn)的各項要求。

表7 最佳工藝條件下燕麥黃酒品質(zhì)指標(biāo)Table 7 Basic quality indicators of Chinese oat rice wine under the optimal conditions

3 結(jié)論

通過單因素與正交試驗確定了燕麥黃酒的最佳工藝條件，即最佳液化工藝條件為耐高溫α-淀粉酶添加量為5 U/g、液化溫度95 ℃、液化時間40 min；最佳糖化條件為糖化酶添加量100 U/g、糖化溫度65 ℃、糖化時間180 min；最佳主發(fā)酵工藝條件為料液比1∶3.5、發(fā)酵溫度30 ℃、酵母添加量為0.25%、發(fā)酵時間5 d。在此條件下，16 ℃穩(wěn)定30 d后得到燕麥黃酒。酒樣分析結(jié)果符合國家標(biāo)準(zhǔn)的各項要求。本研究及結(jié)果可為燕麥黃酒工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

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