基于響應(yīng)面設(shè)計(jì)的駱駝蓬總生物堿提取工藝的研究

廖天江

（甘肅工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 化工學(xué)院，甘肅 天水 741025）

駱駝蓬（Peganum harmalaL.）為蒺藜科（Zygophyllaceae）駱駝蓬屬（Peganum）多年生草本植物，又名駱駝?shì)铩⑸撑疃?、苦苦菜、臭草等。在我國，駱駝蓬主要分布于甘肅、寧夏、內(nèi)蒙古、新疆、西藏等地，性平味苦辛，有毒，種子或全草入藥，對(duì)咳嗽氣喘、無名腫痛、風(fēng)濕痹痛等癥均有較好的療效[1-2]。駱駝蓬作為西北地區(qū)重要的民間藥，其全草含多種生物堿，具有廣泛的藥理作用，具有抗菌、抑制細(xì)胞免疫和體液免疫、抑制晶狀體上皮細(xì)胞組織化生和增殖、抗腫瘤和一定的抗病毒等作用[3-4]。駱駝蓬生物堿具有廣泛的生物活性，對(duì)心血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)的作用等[5-9]。研究發(fā)現(xiàn)，駱駝蓬粗提物有抗腫瘤、消炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化酶等多方面的生物活性[10-13]。本試驗(yàn)為研究駱駝蓬總生物堿的提取工藝，通過響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行提取工藝的優(yōu)選，進(jìn)而得出最佳提取方案[14-16]；在提取過程中，采用超聲輔助法，提高了提取率，并使產(chǎn)品易于純化，保持良好的活性[17-18]。對(duì)最佳工藝下提取的駱駝蓬總生物堿進(jìn)行高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）測(cè)定，以確定提取效果，這將為駱駝蓬這一植物資源的深層次開發(fā)利用提供了一定的理論依據(jù)和借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 藥材

駱駝蓬，采自甘肅省蘭州市秦王川山區(qū)，經(jīng)中國科學(xué)院西北高原生物研究所趙強(qiáng)博士鑒定為蒺藜科（Zygophyllaceae）駱駝蓬屬（Peganum）駱駝蓬（Peganum harmalaL.），除雜、自然風(fēng)干、粉碎、過60目篩、備用。

1.1.2 化學(xué)試劑

駱駝蓬堿標(biāo)準(zhǔn)品：美國Sigma公司；體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇、甲醇（色譜純）和KH2PO4（色譜純）：德國默克MERCK公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1100高效液相色譜儀：美國安捷倫公司；UV751GD型紫外-可見分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；RE52-99型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；SHB-Ⅳ型雙A 循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；JY型電子天平：上海方瑞儀器有限公司；SXT-06索氏提取器：上海本昂科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制

準(zhǔn)確配制100 mL的質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的駱駝蓬堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液，然后依次精確量取1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL、8 mL、9 mL于100 mL容量瓶中，用去離子水稀釋定容，充分振蕩搖勻，得到質(zhì)量濃度分別為10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL、60μg/mL、70μg/mL、80 μg/mL、90 μg/mL的駱駝蓬堿標(biāo)準(zhǔn)品的梯度溶液。分別在波長(zhǎng)為319 nm條件下測(cè)定吸光度值，以三重蒸餾水為參比液，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線[19]。

1.3.2 駱駝蓬總生物堿提取

準(zhǔn)確稱取駱駝蓬的干燥粉末25.0 g于250 mL的燒杯中，加入相應(yīng)體積分?jǐn)?shù)的乙醇，在室溫下封口浸泡5 h，然后進(jìn)行超聲振蕩處理，將處理后的混合物，用索氏提取器進(jìn)行回流提取駱駝蓬生物堿，回流一定的時(shí)間，將回流液經(jīng)減壓抽濾后進(jìn)行減壓濃縮，濃縮至無醇味；將濃縮液轉(zhuǎn)入三角瓶中，用活性炭脫色，搖勻，封口，靜置過夜，抽濾，將濾液按編號(hào)裝入50 mL容量瓶，并定容，靜置待測(cè)定。以駱駝蓬堿標(biāo)準(zhǔn)品為標(biāo)準(zhǔn)品，在波長(zhǎng)319 nm處測(cè)定吸光度值，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計(jì)算駱駝蓬總生物堿的含量。

1.3.3 響應(yīng)面法優(yōu)化駱駝蓬生物堿提取條件

通過文獻(xiàn)資料的查詢和課題組的研究，選取主要影響駱駝蓬生物堿提取的乙醇體積分?jǐn)?shù)（%）、液料比（mL∶g）、回流時(shí)間（h）、超聲時(shí)間（min）為主要的考察因素，使用Design-Expert 8.0.5軟件，結(jié)合Box-Behnken中心組合進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以駱駝蓬總生物堿的含量為響應(yīng)值，通過響應(yīng)面分析（response surface analysis，RSA），設(shè)計(jì)4因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，對(duì)駱駝蓬總生物堿提取條件進(jìn)行優(yōu)化[20-24]。

1.3.4 駱駝蓬總生物堿的HPLC測(cè)定

色譜條件：色譜柱選擇為Agilent Eclipse XDB C18柱（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：A液為pH=2.5，濃度為0.01 mol/L的KH2PO4，B液為甲醇，洗脫比例為A∶B=6∶2（V/V）；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為319 nm；溫度為（25±1）℃；進(jìn)樣量為20 μL，在此條件下測(cè)定樣品中駱駝蓬總生物堿含量，并進(jìn)行回收率的計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 駱駝蓬總生物堿的測(cè)定

圖1 駱駝蓬生物堿標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of Harmine

通過對(duì)駱駝蓬生物堿標(biāo)準(zhǔn)品的濃度梯度溶液在波長(zhǎng)319 nm處吸光度值的測(cè)定，以駱駝蓬生物堿標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)（y），得到駱駝蓬生物堿標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。經(jīng)分析得回歸方程：y=0.0054x+0.068 7，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 6。結(jié)果表明，在10～90 μg/mL范圍內(nèi)，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，以A（乙醇體積分?jǐn)?shù)）、B（液料比）、C（回流時(shí)間）、D（超聲時(shí)間）為自變量，駱駝蓬總生物堿的含量為響應(yīng)值（Y），進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表1，模型方差分析結(jié)果見表2所示。

表1 Box-Behnken Design試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 Designation and results of Box-Behnken Design

通過Design-Expert 8.0.5軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，再經(jīng)過二次回歸擬合，得到試驗(yàn)設(shè)定的4個(gè)因素與響應(yīng)值之間的模擬方程為：

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)回歸統(tǒng)計(jì)分析Table 2 Regression statistical analysis of response surface methodology

由表2可知，對(duì)試驗(yàn)設(shè)計(jì)模型進(jìn)行F值檢驗(yàn)，結(jié)果表明，試驗(yàn)設(shè)計(jì)模型達(dá)到極顯著水平（P＜0.019）；而失擬項(xiàng)同樣達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）；并且，得到的決定系數(shù)R2=0.893 7；這些結(jié)果表明，試驗(yàn)所設(shè)計(jì)的試驗(yàn)?zāi)M與實(shí)際試驗(yàn)比較接近，且誤差較小，可以反映出各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)內(nèi)在關(guān)系[25-26]。并且，這些因素對(duì)響應(yīng)值的影響非簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，其中D、AD、A2、B2、D2均達(dá)到極顯著影響水平（P＜0.01），A、C、C2達(dá)到顯著影響水平（P＜0.05）。

2.3 響應(yīng)面分析與優(yōu)化

結(jié)合擬合函數(shù)，對(duì)回歸方程模型方程繪制曲面，用以直觀反映局部參數(shù)值和整體響應(yīng)值的交互影響，這將便于考察各因素之間相互關(guān)系對(duì)駱駝蓬總生物堿含量影響，響應(yīng)面分析結(jié)果如圖2所示。

響應(yīng)面的圖形，是各試驗(yàn)因子在三維空間對(duì)響應(yīng)值所構(gòu)成的的曲面圖，可以形象的看出各因素之間的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響，即各因素曲線走勢(shì)的陡峭程度，決定其自身對(duì)響應(yīng)值影響的顯著程度。由圖2可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)、回流時(shí)間和超聲時(shí)間的圖形曲線走勢(shì)較為陡，說明其對(duì)響應(yīng)值的影響是較為顯著的。由Design-Expert 8.0.5軟件進(jìn)行系統(tǒng)分析，結(jié)合模擬得到駱駝蓬總生物堿的提取工藝，最終確定駱駝蓬總生物堿的最佳提取工藝條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)為40.0%，液料比15.0（mL∶g）、回流時(shí)間2.3 h、超聲時(shí)間10.5 min。在此工藝條件下駱駝蓬總生物堿含量為11.34%。

將此工藝下提取的駱駝蓬總生物堿樣品采用HPLC進(jìn)行定性檢測(cè)，在1.3.4的色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見圖3。

圖2 各因素交互作用對(duì)駱駝蓬總生物堿含量影響的響應(yīng)面和等高線Fig.2 Response surface plot and contour line of interaction among each factors on total alkaloid content in P.harmala

由圖3可知，標(biāo)準(zhǔn)品駱駝蓬堿的保留時(shí)間tR=7.631 min，而提取的駱駝蓬總生物堿樣品保留時(shí)間tR=7.662 min；并且樣品的分離較為理想，這表明駱駝蓬的提取物中含駱駝蓬總生物堿。通過對(duì)回收率的計(jì)算，得到平均回收率為98.86%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為3.92%。結(jié)果表明，通過優(yōu)化所建立的駱駝蓬生物堿的提取工藝是合理的，試驗(yàn)方法的設(shè)計(jì)是可行的，這一工藝可以作為駱駝蓬總生物堿提取的參考條件，為駱駝蓬這一民間藥材的開發(fā)和利用提供了科學(xué)的依據(jù)。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)品（A）及樣品（B）HPLC檢測(cè)結(jié)果Fig.3 HPLC detection results of standard（A）and sample（B）

3 結(jié)論

本研究采用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分析幾種因素間的交互作用，以達(dá)到較全面地反映各因素水平的效果。結(jié)果表明：駱駝蓬總生物堿最佳提取工藝條件是：乙醇體積分?jǐn)?shù)40.0%，液料比15.0（mL∶g），回流時(shí)間2.3 h、超聲時(shí)間10.5 min。此工藝條件下駱駝蓬總生物堿含量為11.34%。在設(shè)定的色譜條件下，平均回收率為98.76%，RSD為3.92%，表明試驗(yàn)方法設(shè)計(jì)合理，數(shù)據(jù)真實(shí)可靠。通過研究，為今后我國西北藥用植物駱駝蓬的開發(fā)提供一定的參考依據(jù)。

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