Alcalase 2.4L堿性內(nèi)切酶和Flavourzyme風(fēng)味酶酶解大豆分離蛋白及脫苦工藝優(yōu)化

孫 勇

（北京市食品研究所，北京 100162）

大豆中含有豐富的蛋白質(zhì)及近20種氨基酸，其中含有人體必需氨基酸，營(yíng)養(yǎng)豐富，不含膽固醇，與乳、肉和雞蛋等動(dòng)物蛋白相比，大豆蛋白具有較強(qiáng)的價(jià)格優(yōu)勢(shì)[1]。但大豆蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，相對(duì)分子質(zhì)量較大，溶解性差，消化率和生物效價(jià)不及牛乳等動(dòng)物蛋白質(zhì)[2]。通過(guò)生物酶解可以使大豆蛋白這些性質(zhì)得到改善[3]，酶解產(chǎn)物大豆肽比蛋白質(zhì)更易于被人體消化和吸收[4]，且大豆肽具有降血脂[5]、降血壓[6]、抗氧化[7]、提高機(jī)體免疫力[8]等生物活性作用，從而進(jìn)一步拓展了大豆蛋白在食品工業(yè)中的應(yīng)用[9]。同化學(xué)改性相比，酶法改性具有酶解條件溫和、功能性質(zhì)可控等優(yōu)點(diǎn)。生物酶改性作為大豆蛋白改性的一種新興、無(wú)毒副作用、安全的改性方式，具有很重要的研究開發(fā)意義。

近年來(lái)利用酶法對(duì)大豆蛋白的研究較多。錢方等[10-11]對(duì)蛋白酶及其大豆蛋白水解物苦味的研究，得出胃蛋白酶和Alcalase堿性內(nèi)切酶較易產(chǎn)生苦味，并對(duì)大豆苦味肽進(jìn)行了研究，得到苦味肽粗品。但采用多種酶對(duì)大豆蛋白水解液脫苦效果研究尚鮮有報(bào)道。本研究擬采用Alcalase 2.4L堿性內(nèi)切酶和Flavourzyme風(fēng)味蛋白酶對(duì)大豆分離蛋白的水解及脫苦的反應(yīng)進(jìn)行研究和條件優(yōu)化，采用單因素和正交試驗(yàn)確定最佳酶解條件，為工業(yè)化生產(chǎn)功能性大豆多肽提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白：山東禹王集團(tuán)；福林試劑：上海荔達(dá)生物科技有限公司；硼砂：山東黃河龍生物有限公司；三氯醋酸、碳酸鈉：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；酪氨酸：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；奎寧：北京化學(xué)試劑公司；Alcalase堿性內(nèi)切蛋白酶、Flavourzyme風(fēng)味蛋白酶（食用級(jí)）：丹麥諾維信公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ES-300E電子天平、UV-6000分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；DK-S24電熱恒溫水浴鍋：北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司；PH/ORP-1001 pH計(jì)：上海三本環(huán)保科技有限公司；HJ-4恒溫?cái)嚢杵鳎汉ｉT市麒麟醫(yī)用儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 大豆蛋白預(yù)處理

按一定底物濃度配比準(zhǔn)確稱取大豆分離蛋白，配成所需濃度的大豆蛋白溶液，然后在90 ℃水浴加熱10 min，使蛋白質(zhì)適度變性，以易于酶解的進(jìn)行，取出冷卻至室溫，放入恒溫?cái)嚢杵鳌?/p>

1.3.2 酶活力測(cè)定

福林酚試劑在堿性條件下極不穩(wěn)定，易被酚類化合物還原而呈藍(lán)色反應(yīng)[12]。由于蛋白質(zhì)中含有具有酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），因此，蛋白質(zhì)及其水解產(chǎn)物也呈藍(lán)色反應(yīng)。利用蛋白酶分解酪素（底物）生成含酚基氨基酸的呈色反應(yīng)，來(lái)間接測(cè)定蛋白酶的活力。經(jīng)測(cè)定Alcalase堿性內(nèi)切蛋白酶活力為183 100 U/mL，F(xiàn)lavourzyme風(fēng)味蛋白酶活力為25 600 U/g。

1.3.3 水解度的測(cè)定

蛋白質(zhì)的水解度（degree of hydrolysis，DH）是指蛋白質(zhì)水解反應(yīng)過(guò)程中被裂解的肽鍵的百分?jǐn)?shù)。在堿性條件下采用pH-Stat法[13]。計(jì)算公式如下：

式中：DH為水解度，%；B為消耗堿量，mL；N為NaOH 摩爾濃度，mol/L；α為大豆蛋白氨基的平均解離度，當(dāng)pH值為7時(shí)，α=0.44；m為水解液中蛋白質(zhì)的總質(zhì)量，g；h為每克蛋白質(zhì)底物具有的肽鍵毫摩爾數(shù)，mmol/g，對(duì)于大豆分離蛋白h=7.75 mmol/g。

1.3.4 Alcalase 2.4L堿性內(nèi)切酶酶解反應(yīng)

1.3.4.1 單因素試驗(yàn)

配制一定濃度大豆蛋白混合液預(yù)處理后，隨著水解的進(jìn)行，酶解液pH值逐漸下降，滴加0.5 mol/L的NaOH溶液保持pH值為8.0，記錄1 h內(nèi)消耗堿量與時(shí)間關(guān)系，換算成DH值與時(shí)間關(guān)系，繪制成圖，確定最佳加酶量[14]。固定其他條件，分別改變加酶量、底物濃度、溫度、pH值等單一條件，考察Alcalase 2.4L堿性內(nèi)切酶對(duì)大豆蛋白水解度的變化情況。加酶量條件：底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%，酶解溫度60 ℃，酶解pH 8.0，加酶量按酶和底物之比為2 000 U/g、5 000 U/g、8 000 U/g、11 000 U/g、14 000 U/g。底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件：酶解溫度60 ℃、酶解pH 8.0、加酶量10 000 U/g 條件下，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%、3%、5%、7%、9%。酶解溫度條件：底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%、酶解pH8.0、加酶量10 000 U/g，酶解溫度為50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃。酶解pH值條件：底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%、酶解溫度60 ℃、加酶量10 000 U/g條件下，酶解pH值為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。

1.3.4.2 Alcalase酶解條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

Alcalase蛋白酶酶解大豆分離蛋白的最佳條件的確定采用L9（34）正交設(shè)計(jì)，以水解度（DH）為測(cè)定指標(biāo)，考察4個(gè)因素對(duì)水解度的影響，水解時(shí)間為1 h。根據(jù)最佳單因素試驗(yàn)結(jié)果分析，選擇底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、水解溫度、pH值、加酶量進(jìn)行4因素3水平的正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)因素與水平如表1所示。

表1 Alcalase酶解條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for optimizing enzymatic hydrolysis by Alcalase

1.3.5 苦味值的測(cè)定

以奎寧為基準(zhǔn)物質(zhì)，配制標(biāo)準(zhǔn)液。經(jīng)評(píng)定當(dāng)奎寧標(biāo)準(zhǔn)液濃度為c=3×10-6mol/L時(shí)，剛好無(wú)苦味，定c濃度為下限，32c濃度為上限（若再增加奎寧濃度，苦味基本不再增加），在c～32c之間，隨著奎寧濃度增加，苦味值也相應(yīng)增加。設(shè)定苦味值的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2[15]。

表2 苦味值的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Evaluation scores of bitterness value

評(píng)定小組由5人組成，評(píng)定員用蒸餾水漱口后，用一次性吸管取待評(píng)定液2～3 mL置于口中，10 s后吐出，漱口，取苦味程度相近的標(biāo)準(zhǔn)液品嘗，確認(rèn)兩苦味是否相近，若相近即可將待評(píng)定液的苦味值定為該標(biāo)準(zhǔn)液的苦味值，否則需取其他標(biāo)準(zhǔn)液再嘗，直至確定苦味值。結(jié)果取5人平均評(píng)定值[16]。

1.3.6 Flavourzyme風(fēng)味蛋白酶酶解反應(yīng)

（1）單因素試驗(yàn)

對(duì)經(jīng)過(guò)Alcalase 2.4L堿性內(nèi)切酶水解后的水解液進(jìn)行4 h水解，根據(jù)苦味評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。固定其他條件，分別改變加酶量、溫度、pH值、酶解時(shí)間等單一條件，考察Flavourzyme風(fēng)味蛋白酶對(duì)大豆蛋白的水解液苦味值的變化情況。加酶量酶解pH 7，酶解溫度50 ℃，酶解時(shí)間4 h，加酶量分別為100 U/g、150 U/g、200 U/g、250 U/g、300 U/g。酶解溫度：酶解pH 7，加酶量250 U/g，酶解時(shí)間4 h，酶解溫度分別為45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃。酶解pH值：酶解溫度50 ℃，加酶量250 U/g，酶解時(shí)間4 h，酶解pH值分別為5、6、7、8、9。酶解時(shí)間：酶解pH 7，酶解溫度50 ℃，加酶量250 U/g，酶解時(shí)間分別為1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h。

（2）Flavourzyme風(fēng)味蛋白酶脫苦工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

Flavourzyme風(fēng)味蛋白酶酶解大豆分離蛋白的最佳脫苦條件的確定采用L9（34）正交設(shè)計(jì)，以苦味值為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察酶解溫度、酶解pH值、加酶量、反應(yīng)時(shí)間4個(gè)因素對(duì)水解液苦味評(píng)分的影響。正交試驗(yàn)因素與水平如表3所示。

表3 Flavourzyme風(fēng)味蛋白酶脫苦工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 3 Factors and levels of orthogonal tests for optimizing debittering process by Flavourzyme

2 結(jié)果與分析

2.1 Alcalase 2.4L酶酶解單因素試驗(yàn)結(jié)果

Alcalase 2.4L酶解單因素試驗(yàn)結(jié)果見圖1。由圖1A可看出，Alcalase 2.4L酶解實(shí)驗(yàn)過(guò)程中隨著加酶量的增加，水解度顯著增加，但當(dāng)加酶量＞11 000 U/g后，水解速度減慢，曲線趨于水平，因此考慮酶解效果，Alcalase 2.4L酶加酶量為11 000 U/g時(shí)較為適宜。

如圖1B所示，在底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低時(shí)，大豆分離蛋白的水解度較高，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，水解度出現(xiàn)下降趨勢(shì)，原因可能是由于大豆分離蛋白溶解度不高，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)過(guò)高時(shí)會(huì)造成水解液黏度增大，影響蛋白酶的擴(kuò)散，從而抑制水解反應(yīng)的進(jìn)行。因此，考慮到酶解效率和生產(chǎn)成本，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)在3%～5%較為適宜。

由圖1C可看出，酶解溫度為50～60 ℃時(shí)，水解度隨溫度的升高而增大；但溫度＞65 ℃后，水解度迅速下降。因此，Alcalase 2.4L蛋白酶酶解大豆分離蛋白的最適溫度為55～65 ℃。

如圖1D所示，Alcalase 2.4L蛋白酶在pH 7.5～8.5 時(shí)對(duì)大豆分離蛋白的水解能力較強(qiáng)。

2.2 Alcalase 2.4L酶酶解條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

由表4極差分析可知，各因素影響效果主次關(guān)系為C＞A＞D＞B，即pH值＞加酶量＞底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞溫度，同時(shí)，得出最優(yōu)組合為C3A3D2B2，即加酶量14 000 U/g、酶解溫度60 ℃、酶解pH 8.5、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%。在此最佳條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，水解1 h的水解度為41.95%。

圖1 Alcalase 2.4L酶加酶量(A)、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)(B)、酶解溫度(C)及酶解pH值(D)對(duì)大豆分離蛋白水解度的影響Fig.1 Effect of Alcalase 2.4L addition (A),substrate concentration(B),hydrolysis temperature (C) and hydrolysis pH (D) on hydrolysis degree of SPI

2.3 酶解反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶解度的影響

由圖2可知，Alcalase 2.4L蛋白酶在120 min時(shí)水解度最高，可達(dá)45.34%，此時(shí)水解液為清澈透明的淺黃色液體，僅有少量沉淀。繼續(xù)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，水解度增長(zhǎng)趨勢(shì)不明顯，因此最佳水解時(shí)間應(yīng)為2h。

表4 Alcalase 2.4L酶酶解條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 4 Results and analysis of orthogonal tests for optimizing enzymatic hydrolysis by Alcalase

圖2 酶解反應(yīng)時(shí)間對(duì)水解度的影響Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis time on hydrolysis degree of SPI

2.4 苦味分值測(cè)定

大豆蛋白經(jīng)酶解后往往會(huì)產(chǎn)生一種令人難以接受的苦味，會(huì)影響其在食品中的應(yīng)用，因此本實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)了在最佳酶解條件下的酶解液的苦味值。由五位評(píng)定員品嘗并打分后得出結(jié)論，在最佳酶解條件下（加酶量14 000 U/g，酶解溫度60 ℃，酶解pH 值為8.5，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%，酶解時(shí)間2 h），Alcalase 2.4L蛋白酶水解液苦味評(píng)分為4。

2.5 Flavourzyme風(fēng)味蛋白酶酶解單因素試驗(yàn)結(jié)果

Flavourzyme風(fēng)味蛋白酶酶解單因素試驗(yàn)結(jié)果見圖3。由圖3A可以看出，隨著酶添加量的增大，大豆分離蛋白酶水解產(chǎn)物苦味評(píng)分逐步降低，即苦味逐漸變小，當(dāng)酶用量＞250 U/g時(shí)苦味幾乎不變。這主要是由于風(fēng)味酶是以疏水性專一的外切蛋白酶為主，水解后使疏水性氨基酸較多地位于多肽的末端或從游離出來(lái)，從而苦味較低。

圖3 Flavourzyme酶加酶量(A)、酶解溫度(B)、酶解pH值(C)及酶解時(shí)間(D)對(duì)大豆分離蛋白苦味分值的影響Fig.3 Effect of Flavourzyme addition (A),hydrolysis temperature (B),hydrolysis pH (C) and hydrolysis time (D) on bitterness value of SPI

由圖3B可以看出，隨反應(yīng)溫度升高，酶解液苦味評(píng)分下降，在50～60 ℃時(shí)苦味最小。繼續(xù)升高溫度，苦味評(píng)分反而略有增大。這是因?yàn)镕lavourzyme風(fēng)味蛋白酶的最適溫度在50 ℃左右，溫度太低，酶活性達(dá)不到最高。而溫度過(guò)高時(shí)，對(duì)Flavourzyme風(fēng)味蛋白酶的活性有抑制作用，使其達(dá)不到最佳酶解效果。

由圖3C可以看出，pH值5.0～7.0階段，苦味評(píng)分逐漸減小為1.4，而pH值由7.0升至8.0時(shí)，苦味評(píng)分又逐漸增大，從而確定適宜pH值為7.0左右。

由圖3D可以看出，隨水解的進(jìn)行，苦味評(píng)分逐漸降低，在4 h時(shí)苦味最小，4～5 h時(shí)苦味幾乎不再變化，因此適宜酶解時(shí)間范圍確定在3～5 h。

2.6 Flavourzyme風(fēng)味蛋白酶脫苦工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

表5 Flavourzyme酶脫苦工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 5 Results and analysis of orthogonal tests for optimizing debitterizing process by Flavourzyme

由表5極差分析可知，各因素影響苦味評(píng)分的主次關(guān)系為D＞A＞B＞C，即加酶量＞酶解pH值＞酶解溫度＞酶解時(shí)間，同時(shí)，得出最佳脫苦工藝條件為A2B2C1D3，即加酶量300 U/g、酶解溫度55 ℃、酶解pH 7.0、酶解時(shí)間3 h。在此最佳條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，苦味值為1.2，水解液幾乎無(wú)苦味，脫苦效果理想。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究了以Alcalase 2.4L堿性內(nèi)切酶水解大豆分離蛋白制備大豆肽的工藝，同時(shí)通過(guò)加入Flavourzyme風(fēng)味蛋白酶改善酶解液苦味。通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)得到了Alcalase 2.4L堿性內(nèi)切酶和Flavourzyme風(fēng)味蛋白酶水解大豆分離蛋白的最佳水解工藝，使水解度得到較大提高的同時(shí)也解決了水解液的苦味問(wèn)題。結(jié)果表明，Alcalase 2.4L堿性內(nèi)切酶酶解最優(yōu)條件是：酶解pH 8.5、酶解溫度60 ℃、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%、加酶量為14 000 U/g，酶解時(shí)間2 h，水解度可達(dá)45.34%，水解液苦味值為4；繼續(xù)加入Flavourzyme風(fēng)味蛋白酶反應(yīng)，水解液苦味值大大降低。試驗(yàn)證明，F(xiàn)lavourzyme風(fēng)味蛋白酶脫苦工藝最佳條件是酶解溫度55 ℃、酶解pH 7.0、加酶量300 U/g、酶解時(shí)間3 h，可使苦味值降低為1.2。

一般來(lái)說(shuō)內(nèi)肽酶水解物易產(chǎn)生苦味，而外肽酶水解物基本上不產(chǎn)生苦味，故Alcalase堿性內(nèi)切酶水解大豆分離蛋白后水解物往往產(chǎn)生一種令人難以接受的苦味，隨著大豆蛋白水解度的增大，原來(lái)包裹在分子內(nèi)部呈苦味的疏水性基團(tuán)暴露出來(lái)，含有的疏水性基團(tuán)的多肽會(huì)使人的味蕾產(chǎn)生苦味。通過(guò)加入Flavourzyme風(fēng)味蛋白酶可以進(jìn)行脫苦處理，可以將疏水性氨基酸從蛋白質(zhì)末端切掉，由于有利的疏水性氨基酸并不產(chǎn)生苦味，因此可以有效地減少水解液的苦味。在最佳酶解條件下，苦味分值達(dá)到最低，取得了較好的脫苦效果。

[1]武瑩浣.大豆分離蛋白的堿性蛋白酶酶解條件研究[J].中國(guó)釀造，2012，31（5）：141-143.

[2]孫 旸，陳 光，劉艷秋.Alcalase 堿性蛋白酶水解大豆分離蛋白的研究[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，27（2）：162-166.

[3]王 月，張東杰.中性蛋白酶酶解酰化大豆分離蛋白功能特性的研究[J].食品科學(xué)，2011，32（13）：234-238.

[4]李善仁，陳濟(jì)琛，胡開輝，等.大豆肽的研究進(jìn)展[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2009，24（7）：142-147.

[5]包樂(lè)媛，張業(yè)尼，錢 磊，等.大豆肽對(duì)高脂血癥大鼠的降脂作用[J].大豆科學(xué)，2007，26（5）：752-756.

[6]盧 靜，趙春燕，張學(xué)新，等.大豆肽對(duì)大鼠血壓及血漿血管緊張素的影響[J].營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2008，30（5）：508-511.

[7]榮建華，李小定，謝筆鈞.大豆膚體外抗氧化效果的研究[J].食品科學(xué)，2002，23（11）：118-121.

[8]李紅勝，高存川，謝為天，等.大豆肽對(duì)小鼠免疫功能的影響[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，45（5）：109-112.

[9]WU W,HETTIARACHCHY N S,QI M.Hydrophobicity,solubility,and emulsifying properties of soy protein peptides prepared by papain modification and ultrafiltration[J].J AOCS,1998,75(7):845-850.

[10]錢 方，鄧 巖，王鳳翼，等.蛋白酶及其大豆蛋白水解物苦味的研究[J].大連輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)，2000，20（3）：182-186.

[11]錢 方，王鳳翼，鄧 巖，等.胃蛋白酶酶解大豆蛋白苦味肽的粗分離[J].中國(guó)乳品工業(yè)，2002，30（2）：20-23.

[12]鄧 勇，吳煜歡.微生物蛋白酶對(duì)大豆分離蛋白水解作用的研究[J].食品科學(xué)，1999，20（6）：42-45.

[13]輕工業(yè)部食品工業(yè)司.QB/T1803—1993 工業(yè)酶制劑通用實(shí)驗(yàn)方法[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，1994.

[14]趙新淮，馮志彪.大豆蛋白水解物水解度測(cè)定的研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1995，26（2）：178-181.

[15]孫君社，薛 毅.食品感官鑒評(píng)[M].廣州：華南理工大學(xué)出版社，1994.

[16]吳 瓊，程建軍，楊秋萍，等.堿性蛋白酶水解大豆分離蛋白的研究[J].食品工業(yè)科技，2009，30（10）：191-193.