北京地區(qū)四個規(guī)?；i場的豬鏈球菌病流行病學(xué)調(diào)查

劉修權(quán) 賈澤穎 孫玉芳 劉鄧 郭又春 全炎銘 劉莉如

（北京三元集團畜牧獸醫(yī)總站，北京 100192）

北京地區(qū)四個規(guī)模化豬場的豬鏈球菌病流行病學(xué)調(diào)查

劉修權(quán) 賈澤穎 孫玉芳 劉鄧 郭又春 全炎銘 劉莉如

（北京三元集團畜牧獸醫(yī)總站，北京 100192）

本試驗從北京地區(qū)四個規(guī)?；i場的74頭疑似豬鏈球菌病的仔豬組織中分離培養(yǎng)獲得56株豬源鏈球菌，并進行了API 20 Strep生化鑒定、16S rRNA基因序列比對和藥敏試驗。試驗結(jié)果表明：56株豬源鏈球菌分別屬于糞腸球菌、屎腸球菌、鳥鏈球菌、馬鏈球菌獸疫亞種、豕鏈球菌和豬鏈球菌，其中以蘭氏D群糞腸球菌為主（23/56，41.07%），其次為蘭氏C群馬鏈球菌獸疫亞種（14/56，25.00%）；對10種臨床常用抗生素均產(chǎn)生了耐藥性，耐藥比例從12.50%至92.86%不等，對紅霉素的耐藥比例最高（52/56，92.86%），對新霉素的耐藥比例最低（7/56，12.50%），且多重耐藥性現(xiàn)象極為嚴峻。

豬鏈球菌病；血清分群；藥敏試驗

豬鏈球菌?。⊿wine Streptococosis）是由鏈球菌感染引起的豬的一類疫病的總稱，其病原主要包括馬鏈球菌獸疫亞種（Streptococcus cqui subsp zooepodemicus），蘭氏分群中的D、E、L群鏈球菌以及豬鏈球菌（Strptococcussuis）[1]。該病分布廣泛，世界各地均有不同程度的流行[2]。我國豬鏈球菌病較大范圍的流行始于1963年廣西省部分地區(qū)，而其在20世紀70年代至80年代之間日趨嚴重，許多地方呈暴發(fā)流行或地方性流行[3]。后隨著疫苗的研制和推廣，馬鏈球菌獸疫亞種所致豬鏈球菌病的蔓延得到了一定程度的遏制。然而20世紀90年代初，廣東首次報道了2型豬鏈球菌致病[4]，此后多地又陸續(xù)報道了該型豬鏈球菌病的發(fā)生[5]。

目前，疫苗免疫和抗生素治療是防控該病的主要措施。但由于致病性鏈球菌血清型繁多，各血清型菌株之間缺乏有效的交叉免疫保護[6]，且鏈球菌易產(chǎn)生耐藥性，給疫病的防治帶來了困難。本研究對北京地區(qū)四個規(guī)模化豬場疑似豬鏈球菌病的仔豬病例進行了組織分離培養(yǎng)，并在此基礎(chǔ)上系統(tǒng)開展了鏈球菌蘭氏血清分群、API 20 Strep生化鑒定、16S rRNA基因序列比對和藥敏試驗等工作，以期探明本病在該地區(qū)的流行規(guī)律，為針對性地選用疫苗和抗生素防控該病提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

標準菌株引自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；API Strep 20生化鑒定試劑條購自法國生物梅里埃公司；7%綿羊血瓊脂培養(yǎng)基購自安圖綠科生物工程有限公司；其他培養(yǎng)基干粉購自英國OXID公司，按說明書自行配制；細菌基因組DNA提取試劑盒、Taq DNA聚合酶、Taq PCR Master Mix均購自天根生化科技（北京）有限公司；PCR引物由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司合成；藥敏紙片購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌的分離培養(yǎng)

根據(jù)臨床癥狀挑選疑似豬鏈球菌病的仔豬病例，剖檢后采集脾臟、淋巴結(jié)和關(guān)節(jié)液等病料，無菌接種于7%綿羊血瓊脂平板，37℃恒溫培養(yǎng)18～24小時，觀察菌落形態(tài)。挑取可疑菌落純化培養(yǎng)后保存，以供后續(xù)試驗用。

1.2.2 生化鑒定

將純化培養(yǎng)后的可疑菌株接種于胰蛋白胨大豆瓊脂表面培養(yǎng)基（TSA），37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，以玻片法進行觸酶試驗。觸酶試驗陽性者，取新鮮純培養(yǎng)物用API 20 Strep生化鑒定試劑條進行生化鑒定，操作方法和判定標準見說明書。

1.2.3 16S rRNA PCR檢測

按細菌基因組DNA提取試劑盒操作說明，提取細菌基因組DNA。參照參考文獻[7]設(shè)計、合成、擴增完整16S rRNA基因的PCR引物，上游引物序列為5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，下游引物序列為5′-TACGGYTACCTT GTTACGACTT-3′。

PCR反應(yīng)體系為：2×Easy Taq PCR Super Mix 25μL，Primer 5和Primer 6（10μmol/L）各1μL，dd H2O 2μL，DNA模板1μL；反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4分鐘，94℃變性30秒，65℃退火40秒，72℃延伸90秒，擴增35個循環(huán)，然后72℃延伸10分鐘，4℃保存。擴增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠進行電泳分析，并送至深圳華大基因科技服務(wù)有限公司進行測序拼接。將測得序列通過NCBI的Blast檢索系統(tǒng)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/）進行同源性分析。

1.2.4 藥敏試驗

根據(jù)美國臨床和實驗室標準協(xié)會（NCCLS）的操作和判定標準[8]，采用藥敏紙片擴散法（K-B法）對分離到的各菌株進行藥敏試驗。藥敏紙片種類包括：青霉素（P）、氨芐西林（AM）、鏈霉素（S）、慶大霉素（GM）、氯霉素（C）、紅霉素（E）、新霉素（N）、四環(huán)素（TE）、諾氟沙星（NOR）及環(huán)丙沙星（CIP）。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)病情況

從北京地區(qū)四個規(guī)?；i場收集臨床疑似豬鏈球菌病的病例共計74例。所有病例均為保育階段以下的豬只，其中慢性型病例占47.30%（35/74），急性敗血型（敗血癥）病例占18.92%（14/74），腦膜炎型（神經(jīng)癥狀）病例占9.46%（7/74），混合癥狀的病例占24.32%（18/74）。

2.2 細菌分離和生化鑒定

本試驗共分離到鏈球菌56株，檢出率為75.68%（56/74）。革蘭氏染色鏡檢均為陽性球菌，液體病料涂片和固體培養(yǎng)物經(jīng)革蘭氏染色鏡檢，可見菌體多為散在狀態(tài)，液體過夜培養(yǎng)物多以長鏈狀態(tài)存在。在去纖維綿羊血瓊脂平板培養(yǎng)時，菌落溶血狀態(tài)不一，表現(xiàn)為α溶血、β溶血或不溶血。觸酶試驗均為陰性，API 20 Strep生化條鑒定后，判定上述菌株均為鏈球菌屬，結(jié)果如表1所示：糞腸球菌23株，占41.07%；屎腸球菌8株，占14.29%；馬鏈球菌獸疫亞種14株，占25.00%；堅忍鏈球菌1株，占1.79%；鳥鏈球菌2株，占3.57%；1型豬鏈球菌2株，占3.57%；2型豬鏈球菌1株，占1.79%；豕鏈球菌1株，占1.79%；未能鑒定出的菌株4株，占7.14%。各分離株的生化反應(yīng)差異較大，且鑒定為同一菌名的細菌之間生化反應(yīng)也存在一定程度的差異。

表1 鏈球菌分離株統(tǒng)計表

2.3 16S rRNA PCR產(chǎn)物序列比對

對56株細菌的16S rRNA基因進行PCR和瓊脂糖凝膠電泳后，均在1 500 bp處出現(xiàn)特異性電泳條帶。對各擴增子進行測序后，得到序列峰圖，各引物的下游800 bp以內(nèi)均無套峰或重峰等現(xiàn)象，且信號強度良好，說明測序結(jié)果完全滿足后續(xù)序列拼接要求。

將各菌株的上游引物測得序列反向互補后，用LaserGene軟件包中的MegAlign子軟件與對應(yīng)下游引物測得序列進行比對，得到1 500 bp左右的拼接序列。進一步將拼接后的序列通過NCBI的Blast檢索系統(tǒng)與基因庫中所有序列進行同源性比對，同源性高于95%者表明與基因庫中登記菌株屬于相同細菌。結(jié)果如表1所示：糞腸球菌23株；屎腸球菌9株；馬鏈球菌獸疫亞種14株；鳥鏈球菌2株；1型豬鏈球菌2株；2型豬鏈球菌1株；7型豬鏈球菌1株；9型豬鏈球菌3株；豕鏈球菌1株。

2.4 藥敏試驗

由表2可知，56株分離株已對臨床上常用的多種抗生素產(chǎn)生了耐藥性，耐藥比例從12.50%至92.86%不等。對紅霉素的耐藥比例高達92.86%，其次為青霉素、鏈霉素、氯霉素、環(huán)丙沙星、慶大霉素、氨芐西林、諾氟沙星、四環(huán)素和新霉素，耐藥比例分別為87.50%、82.14%、73.21%、57.14%、42.86%、28.57%、26.79%、16.07%及12.50%。

表2 K-B法藥敏試驗結(jié)果

3 討論

豬鏈球菌病分布廣泛，世界各地均有不同程度的流行。在我國，該病對飼養(yǎng)密度較大的規(guī)?；i場危害日益嚴重，制約著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。疫苗免疫和抗生素治療是防控該病的主要措施。然而，由于致病性鏈球菌血清型繁多且缺乏有效的交叉免疫保護，再加上細菌耐藥現(xiàn)象日益嚴峻，給該病的防治帶來了困難[9]。北京地區(qū)許多規(guī)?；i場時有豬鏈球菌病的發(fā)生，為有效防控該病的流行，有必要對該病進行流行病學(xué)調(diào)查。

本研究從北京地區(qū)四個規(guī)?；i場篩選了74頭疑似豬鏈球菌病的仔豬病例，通過組織分離培養(yǎng)獲得56株豬源鏈球菌，并進行了生化鑒定和16S rRNA基因序列比對。所有74頭病例均為保育階段以下的豬只，其中慢性型病例有35頭，占比最高，達47.30%。慢性型的病例臨床上主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、化膿性淋巴結(jié)炎、皮炎等癥狀，病程多達十幾天至一個多月，癥狀較緩和。綜合生化鑒定和16S rRNA測序比對結(jié)果，確定北京地區(qū)豬鏈球菌病的病原主要為蘭氏D群鏈球菌（糞腸球菌、屎腸球菌、堅忍鏈球菌和鳥鏈球菌），占60.71%（34/56），其次為蘭氏C群，占25.00%（14/56），這與國內(nèi)的一些報道結(jié)果一致[10]。值得注意的是，本研究中采用API 20 Strep生化鑒定和16S rRNA測序進行結(jié)果比對，符合率為91.07%，差異主要表現(xiàn)在5株細菌（表1）。其中，1株細菌API 20 Strep生化鑒定結(jié)果為堅忍鏈球菌，而16S rRNA測序結(jié)果鑒定為屎腸球菌；4株細菌API 20 Strep未能鑒定出，而16S rRNA測序結(jié)果分別為7型和9型豬鏈球菌。由于鏈球菌血清型眾多，不同鏈球菌菌株之間存在表型差異，表現(xiàn)為生化反應(yīng)譜之間的差異，而16S rRNA基因的核苷酸序列在同種或同型鏈球菌之間高度保守。本試驗結(jié)果表明，16S rRNA基因序列測定可以用于豬鏈球菌病病原菌的鑒定。

本研究藥敏試驗結(jié)果表明，分離到的鏈球菌對臨床上常用的10種抗生素均產(chǎn)生了不同程度的耐藥性，對紅霉素的耐藥比例高達92.86%，對新霉素的耐藥比例最低，但也達到了12.50%。值得注意的是，56株細菌的多重耐藥現(xiàn)象極為嚴峻和復(fù)雜，共有56種耐藥譜。其中，二重和三重耐藥譜各有2種耐藥譜，菌株數(shù)各為2株，分別占3.57%；四重耐藥有14種耐藥譜，菌株數(shù)為19株，占33.93%；五重耐藥有12種耐藥譜，菌株數(shù)為15株，占26.79%；六重耐藥有5種耐藥譜，菌株數(shù)為12株，占21.43%；七重耐藥有4種耐藥譜，菌株數(shù)為4株，占7.14%；八重和九重耐藥各有1種耐藥譜，菌株數(shù)各為1株，各占1.79%。這提示我們應(yīng)合理使用抗生素，嚴控抗生素的濫用。因此，建議有條件的養(yǎng)殖場在治療前先進行藥敏試驗以選用敏感的抗生素。

綜上所述，豬鏈球菌病對北京地區(qū)規(guī)?；i場威脅嚴重，其病原以蘭氏D群鏈球菌為主，且菌株耐藥性問題突出。目前，商品化豬鏈球菌疫苗以C群和2型豬鏈球菌二價聯(lián)苗為主，對該病的防控效果有限。因此，如何有效防控豬鏈球菌病的問題亟待深入研究。

[1] 黃子榮,梁發(fā)朝.豬鏈球菌病的防治措施[J].畜牧獸醫(yī)科技信息,2006（3）：48-49.

[2] 臧瑩安,胡波,頔盧,等.豬鏈球菌及其血清型的PCR檢測[J].仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院學(xué)報,2011,24（3）：9-11.

[3] 丁曉剛,薛小平,田淑琴,等.我國人-豬鏈球菌病研究進展[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2007,29（3）：239-242.

[4] 黃毓茂,黃引賢,余志東,等.2型豬鏈球菌病的初步研究[J].中國畜禽傳染病,1993（5）：1-3.

[5] 姚火春,陳國強,陸承平.豬鏈球菌1998分離株病原特性鑒定[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,1999,22（2）：70-73.

[6] 閆明媚,蘭德松.豬鏈球菌病及其防控對策[J].中國畜牧獸醫(yī)文摘,2011,27（3）：111-112.

[7] 代敏,彭成,陳丹丹,等.全自動微生物分析系統(tǒng)和16S rDNA序列分析技術(shù)對奶牛乳腺炎病原菌的鑒定[J].畜牧與獸醫(yī),2011,43 （9）：28-32.

[8] CLSI/NCCLS document M100-S15.Performance standardsforAntimiarobialSusceptibilityTesting,Fifteenth Informational Supplement[S].2005.

[9] 張丹俊,胡曉苗,趙瑞宏,等.豬鏈球菌病的危害及綜合防治措施[J].獸醫(yī)導(dǎo)刊,2009（8）：18-19.

[10] 馬增軍,李東紅,芮萍,等.冀東地區(qū)豬鏈球菌病流行病學(xué)調(diào)查[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2006,29（4）：84-87.

S851.38

B

1673-4645（2014）07-0033-04

2014-06-26

北京三元種業(yè)科技股份有限公司自立科研課題-豬鏈球菌病病原菌的分離鑒定及其防治研究

劉修權(quán)（1985-），男，碩士，主要從事畜禽疫病檢測工作