Lipozyme TL IM 酶促酯交換棕櫚油中間熔點(diǎn)物制備類可可脂的研究

馬 芳，宋海東，魏安池，趙凱艷，鄭彥芳

（河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001）

0 引言

脂肪酶作為酶類家族中的一員被廣泛用于各行各業(yè)，其中定向脂肪酶因具有良好的反應(yīng)區(qū)域選擇性和立體選擇性，可用于特殊油料的改性，從而改善油脂產(chǎn)品的性質(zhì)，被大量用于油脂化工行業(yè)中[1].其中Lipozyme TL IM 屬于Sn-1，3 位特異性定向脂肪酶，它只識(shí)別水解甘三酯的Sn-1，3 位酯鍵，可用于特殊油料的改性[2].

近年來，隨著食品行業(yè)的快速發(fā)展，其加工工藝不斷提高，類可可脂已經(jīng)逐漸成為一些糕點(diǎn)涂層、代可可脂巧克力的原料，此類可可脂產(chǎn)品不論是在口感上還是營養(yǎng)上，都要比傳統(tǒng)可可脂好[3-4].Daniel Undurraga 等[5]在研究棕櫚油中間熔點(diǎn)物（POMF）制備類可可脂時(shí)，指出通過棕櫚油中間熔點(diǎn)物（POMF）制備類可可脂是可行的，可以獲得一個(gè)與天然可可脂相近熔點(diǎn)的產(chǎn)品，不過后續(xù)的純化是一個(gè)有待解決的問題.Lancelot W Khumalo 等[6]研究目前開發(fā)利用較少的植物油脂制備類可可脂時(shí)，指出油酸含量分別為68%的Strychnos madagascariensis 油料和59%的Ximenia caffra 油料通過酶促酯交換改性后，表現(xiàn)出良好的可可脂性質(zhì)，從而不用作為廉價(jià)的食用油被開發(fā)利用.Kuan-Ju Liu等[7]以豬油為原料，與三硬脂酸甘油酯（StStSt）在超臨界CO2的環(huán)境下制備可可脂代用品，產(chǎn)品熔點(diǎn)為34.5 ℃.Wang Hai-Xiong 等[8]以茶籽油為原料，與棕櫚酸甲酯和硬脂酸甲酯在脂肪酶的作用下制備類可可脂，酯交換后的產(chǎn)品熔點(diǎn)和熔化曲線與天然可可脂的相似.孫曉洋等[9]進(jìn)一步研究茶油制備類可可脂時(shí)提出，使用Lipozyme TL IM 脂肪酶時(shí)的不足在于，茶油雖然Sn-2 位富含油酸，不過棕櫚酸與硬脂酸的含量低，可考慮選用富含β-POP（Sn-2-油酸-1，3-二棕櫚酸甘油酯）或者β-StOSt（Sn-2-油酸-1，3-二硬脂酸甘油酯）等原料制備類可可脂.吳華昌等[10]從油脂甘三酯的角度研究棕櫚油中間熔點(diǎn)物（POMF）在無溶劑體系下制備類可可脂，得到與天然可可脂相容性較好的產(chǎn)品，不過其未對?；灰萍右苑治?作者通過研究適宜的酶環(huán)境和操作條件，以Sn-2 位富含油酸的棕櫚油中間熔點(diǎn)物（POMF）為原料制備類可可脂，并對Sn-2 位油酸轉(zhuǎn)移情況進(jìn)一步分析并優(yōu)化試驗(yàn)，為制定巧克力配方提供一定的理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

棕櫚油中間熔點(diǎn)物（POMF）：實(shí)驗(yàn)室自制；Lipozyme TL IM 脂肪酶：丹麥NOVO 公司；硬脂酸（StA）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；2’，7’-二氯熒光素：上海金穗生物科技有限公司；薄層層析硅膠G：青島海洋化工有限公司.

1.2 儀器與設(shè)備

SHZ-88 型水浴恒溫振蕩器：天壇市醫(yī)療儀器廠；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；Shimadzu GC-2010 型氣相色譜分析儀：蘇州科沃安生物科技有限公司.

1.3 方法

1.3.1 產(chǎn)品的制備

在250 mL 單口圓底燒瓶中稱10 g 棕櫚油中間熔點(diǎn)物（POMF），加熱至80 ℃，待POMF 全部熔化后，緩慢加入硬脂酸（StA）并充分混合溶解，取出圓底燒瓶后再加入一定量的Lipozyme TL IM 固定化脂肪酶，然后將圓底燒瓶移至水浴恒溫振蕩器內(nèi)反應(yīng)，振蕩速度為150 r/min，在一定溫度下反應(yīng)足夠時(shí)間.反應(yīng)完成后，用正己烷洗滌用過的固定化酶，抽濾吸干，最后封存放入冰箱回收利用.所得油樣用濃度為83%的乙醇水溶液，在65 ℃的烘箱中萃取5 次，酸價(jià)小于3 mg/g 后備用.

1.3.2 全樣脂肪酸的組成測定

稱取0.1 g 反應(yīng)物于試管中，加入1.5 mL 正己烷充分溶解后，用帶針頭的注射器抽取一定量的溶液點(diǎn)樣于薄層板上.再將薄層板放入已飽和的展開槽中（展開劑為正己烷∶乙醚∶甲酸=70∶30∶1），待展開劑的液面離薄層底端約1 cm 處時(shí)，取出薄層板充分陰干后，用2’，7’-二氯熒光素溶液噴霧處理，然后刮下甘三酯譜帶并進(jìn)一步甲酯化處理，最后離心取上清液進(jìn)行色譜分析.

色譜條件：檢測器：氫焰離子化檢測器；毛細(xì)管脂肪酸分析柱：120.0 m×0.25 mm×0.25 μm；進(jìn)樣口溫度：230.0 ℃；柱溫：180.0 ℃；檢測器溫度：300 ℃；氮?dú)饬魉伲?.0 mL/min；氫氣流速：46.0 mL/min；空氣流速：399.8 mL/min；進(jìn)樣量3 μL.

1.3.3 Sn-2 位脂肪酸的組成測定

參考GB/T 24894—2010/ISO 6800:1997.

1.3.4 評價(jià)指標(biāo)

式中：37.02 是天然可可脂中硬脂酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù).

式中：66.19 是棕櫚油中間熔點(diǎn)物（POMF）的Sn-2位油酸質(zhì)量分?jǐn)?shù).

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)品主要脂肪酸組成（表1）

表1 主要脂肪酸組成

從表1 可知，天然可可脂脂肪酸特點(diǎn)是Sn-2位以油酸為主[11]，飽和脂肪酸的比例大于不飽和酸.棕櫚油中間熔點(diǎn)物（POMF）的Sn-2 位也以油酸為主，與天然可可脂主要脂肪酸類型是一致的，最大的不同在于硬脂酸含量較低.因此通過Lipozyme TL IM 脂肪酶的Sn-1，3 位定向酯交換特性，引入硬脂酸，以硬脂酸酯交換率為指標(biāo)，Sn-2位油酸的轉(zhuǎn)移率為參考值，分析底物質(zhì)量比、加酶量、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間對整個(gè)反應(yīng)進(jìn)程的影響.

2.2 反應(yīng)條件的確定

2.2.1 棕櫚油中間熔點(diǎn)物（POMF）與硬脂酸（StA）質(zhì)量比對酯交換率和酰基轉(zhuǎn)移率的影響

在加酶量10%，反應(yīng)溫度60 ℃，反應(yīng)時(shí)間12 h 的情況下考察不同底物質(zhì)量比對酯交換率和酰基轉(zhuǎn)移率的影響，結(jié)果見圖1.

圖1 底物質(zhì)量比對酯交換率和?；D(zhuǎn)移率的影響

底物的比例會(huì)影響反應(yīng)的速率和平衡.由圖1可知，隨著硬脂酸加入量的增大，酯交換率呈增大趨勢.不過在底物質(zhì)量比大于1∶1.8 時(shí)，因底物物質(zhì)的量變大，使得促使離子化或是游離的羥基的濃度增大，從而酶周圍微水環(huán)境的酸度變大，導(dǎo)致了酶的活性下降.同時(shí)Sn-2 位油酸的轉(zhuǎn)移率也因反應(yīng)體系酸度的增加，酶活性的降低而有所降低，因此底物質(zhì)量比取1∶1.8.

2.2.2 加酶量對酯交換率和酰基轉(zhuǎn)移率的影響

在底物質(zhì)量比1∶1.8，反應(yīng)溫度60 ℃，反應(yīng)時(shí)間12 h 的情況下，考察加酶量對酯交換率和?；D(zhuǎn)移率的影響，結(jié)果見圖2.

圖2 加酶量對酯交換率和酰基轉(zhuǎn)移率的影響

在底物濃度足夠大時(shí)，Lipozyme TL IM 固定化酶的加入使得酯交換率增加.脂肪酶在整個(gè)反應(yīng)體系中以懸浮狀態(tài)存在，在150 r/min 的轉(zhuǎn)速下，有利于其在反應(yīng)體系中的分布.由圖2 可知，當(dāng)酶濃度增加，酯交換率增加明顯，不過隨著酶濃度的進(jìn)一步增大，底物與酶的結(jié)合區(qū)域變化不大，酯交換率增加緩慢.同時(shí)酶的增加使得整個(gè)反應(yīng)體系中總水分含量的增多，使得反應(yīng)趨勢向水解方向偏移，造成了酸解反應(yīng)酯交換率的下降，同時(shí)?；D(zhuǎn)移率不斷增加，因此加酶量取棕櫚油中間熔點(diǎn)物（POMF）質(zhì)量的10%.

2.2.3 反應(yīng)溫度對酯交換率和?；D(zhuǎn)移率的影響

在底物質(zhì)量比1∶1.8，加酶量10%，反應(yīng)時(shí)間12 h 的情況下，考察反應(yīng)溫度對酯交換率和?；D(zhuǎn)移率的影響，結(jié)果見圖3.

圖3 反應(yīng)溫度對酯交換率和?；D(zhuǎn)移率的影響

由圖3 可知，在溫度大于55 ℃時(shí)酯交換率明顯增加，隨著溫度進(jìn)一步地升高，在大于65 ℃時(shí)酯交換率反而減小.原因是溫度在影響酶催化活性的同時(shí)會(huì)影響底物的黏度，棕櫚油中間熔點(diǎn)物（POMF）在較低溫度下易凝固，低溫影響了反應(yīng)體系的傳質(zhì)速度，進(jìn)而使得酯交換率下降.而過高的溫度不利于酶的反應(yīng)，會(huì)造成酶的失活，重復(fù)使用次數(shù)減少，同時(shí)較高的溫度使得Sn-2 位油酸轉(zhuǎn)移率增加，因此反應(yīng)溫度取60 ℃.

2.2.4 反應(yīng)時(shí)間對酯交換率和?；D(zhuǎn)移率的影響

在底物質(zhì)量比1∶1.8，加酶量10%，反應(yīng)溫度60 ℃的情況下，考察反應(yīng)時(shí)間對酯交換率和酰基轉(zhuǎn)移率的影響，結(jié)果見圖4.

圖4 反應(yīng)時(shí)間對酯交換率和酰基轉(zhuǎn)移率的影響

由圖4 可知，反應(yīng)時(shí)間與反應(yīng)率呈正比關(guān)系，反應(yīng)時(shí)間在12 h 后酯交換率降低，理論上隨著反應(yīng)時(shí)間的不斷加長，酯交換率可以達(dá)到100%，不過12 h 后酯交換率增加緩慢，同時(shí)隨著反應(yīng)的進(jìn)行，副產(chǎn)物也會(huì)隨之增大，?；D(zhuǎn)移率增加，不利于反應(yīng)進(jìn)程的進(jìn)一步研究，因此反應(yīng)時(shí)間取12 h.

2.3 正交試驗(yàn)

綜合考慮各因素對酯交換率和?；D(zhuǎn)移率的影響，取底物質(zhì)量比1∶1.8，加酶量10%，反應(yīng)溫度60 ℃，反應(yīng)時(shí)間12 h 為中心值，分析這4 個(gè)因素對酯交換率的影響，采用正交表L9（34），因素與水平見表2，試驗(yàn)結(jié)果見表3，方差分析見表4.

表2 因素與水平

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 方差分析

對于酯交換率而言，反應(yīng)時(shí)間的極差最小，作為誤差相進(jìn)行方差分析，得出加酶量和反應(yīng)溫度的顯著性高.由于沒有交互作用的影響，因此因素B 和C 的搭配一定是最佳的.因素的主次順序?yàn)锽（加酶量）為主要因素，以B3（12%）為最好，C（反應(yīng)溫度）為相對次要因素，以C2（60 ℃）為最好，而底物質(zhì)量比取A2（1∶1.8），反應(yīng)時(shí)間可任意取一個(gè)水平.通過?；D(zhuǎn)移率的正交分析可知，4 個(gè)因素的極差相對比較接近，不利于做進(jìn)一步方差分析，比較極差值得底物質(zhì)量比在4 個(gè)因素中影響較大，并且以A2（1∶1.8）影響最大.因此，考慮以酯交換率為主要指標(biāo)，綜合得出最優(yōu)方案為B3C2A2D1.在最優(yōu)方案下的酯交換率為75.52%，?；D(zhuǎn)移率為13.96%.

3 結(jié)論

通過正交試驗(yàn)分析，各因素對酶促酯交換棕櫚油中間熔點(diǎn)物（POMF）制備類可可脂的影響作用大小為：加酶量＞反應(yīng)溫度＞底物質(zhì)量比＞反應(yīng)時(shí)間.酯交換最佳條件為：加酶量12%，反應(yīng)溫度60℃，棕櫚油中間熔點(diǎn)物（POMF）與硬脂酸（StA）底物質(zhì)量比1∶1.8、反應(yīng)時(shí)間10 h，在此條件下酯交換率為75.52%，酰基轉(zhuǎn)移率為13.96%.

［1］Rohit Sharma，Yusuf Chisti，Uttam Chand Banerjee.Production，purification，characteriz-ation and applications of lipases［J］.Biotechno-logy Advances，2001，19（8）:627-662.

［2］唐平，雕鴻蓀.用于油脂改性的1，3-定向脂肪酶［J］.中國油脂，1996，21（4）:4-9.

［3］王紅，巢強(qiáng)國，葛宇，等.可可脂及其代用品的特性［J］.食品研究與開發(fā)，2009，30（4）:178-180.

［4］Lipp M，Simoneau C，Ulberth F，et al.Composition of genuine cocoa butter and cocoa［J］.Journal of Food Composition and Analysis，2001，14（4）:399-408.

［5］Daniel Undurraga，Andrés Markovits，Sonia Erazo.Cocoa butter equivalent through enzymic interesterification of palm oil midfraction［J］.Process Biochemistry，2001，36（10）:933-939.

［6］Lancelot W Khumalo，Luke Majoko，John S Read，et al.Characterisation of some underu -tilis ed vegetable oils and their evaluation as starting materials for lipase-catalysed production of cocoa butter equivalents［J］.Industrial Crops and Product，2002，16（3）:237-244.

［7］Kuan-Ju Liu，Hung-Min Chang，Kuan-Miao Liu.Enzymatic synthesis of cocoa butter analog through interesterification of lard and tristearin in supercritical carbon dioxide by lipase［J］.Food Chemistry，2007，100（4）:1303-1311.

［8］Hai-Xiong Wang，Hou Wu，Chi-Tang Ho，et al.Cocoa butter equivalent from enzymatic interesterification of tea seed oil and fatty acid methyl esters［J］.Food Chemistry，2006，97（4）:661-665.

［9］孫曉洋，孟宏昌，畢艷蘭，等.Lipozyme TL IM 脂肪酶催化茶油酯交換制備類可可脂的研究［J］.中國糧油學(xué)報(bào)，2009，24（12）:72-76.

［10］吳華昌，宗敏華，王菊芳，等.無溶劑系統(tǒng)脂肪酶催化POMF 轉(zhuǎn)酯生產(chǎn)類可可脂的研究［J］.中國油脂，2003，28（3）:36-39.

［11］孫曉洋，畢艷蘭，楊國龍.代可可脂、類可可脂、天然可可脂的組成及性質(zhì)分析［J］.中國油脂，2007，32（10）:38-42.