回心草對(duì)兔動(dòng)脈粥樣硬化和缺血心肌血管新生作用的研究

肖繼明，萬文輝，徐　軍

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回心草對(duì)兔動(dòng)脈粥樣硬化和缺血心肌血管新生作用的研究

肖繼明，萬文輝，徐軍*

（南京軍區(qū)南京總醫(yī)院干部心臟內(nèi)科，南京 210002）

建立兔實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈粥樣硬化和心肌梗死雙模型，觀察回心草提取液對(duì)兔動(dòng)脈粥樣硬化斑塊和缺血心肌血管新生的影響。選擇30只家兔，隨機(jī)分為3組，普通飼料對(duì)照組（對(duì)照組），高脂飼料組（高脂組），回心草干預(yù)組（干預(yù)組），每組各10只，共喂養(yǎng)9周。第9周末，采用開胸結(jié)扎兔冠狀動(dòng)脈左前降支（LAD）的方法，建立兔急性心肌梗死模型。實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)，測(cè)定血液生化指標(biāo)，對(duì)血管及心臟組織行病理學(xué)檢查，免疫組化染色測(cè)定心肌組織分化抗原簇34（CD34）及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體2（VEGFR2）陽性反應(yīng)強(qiáng)度。3組比較，高脂組的肌酸激酶同工酶（CK-MB）、肌鈣蛋白I（TnI）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）；干預(yù)組與高脂組比較，TC、TG、CK-MB、TnI明顯下降（＜0.01），LDL-C下降（＜0.05）。高脂組與對(duì)照組病理評(píng)分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）；干預(yù)組的病理評(píng)分較對(duì)照組高，較高脂組低（＜0.05）。高脂組心肌組織CD34和VEGFR2陽性組織相對(duì)灰度值均明顯高于對(duì)照組（＜0.01）；干預(yù)組VEGFR2及CD34表達(dá)水平較對(duì)照組高、較高脂組低（＜0.05）。高脂飼料喂養(yǎng)和開胸結(jié)扎兔冠狀動(dòng)脈LAD的方法可成功建立家兔動(dòng)脈粥樣硬化和急性心肌梗死雙模型。回心草提取液減輕了動(dòng)脈粥樣硬化和心肌缺血壞死，抑制了心肌組織CD34和VEGFR2的表達(dá)。

回心草；動(dòng)脈粥樣硬化；心肌梗死；血管新生

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosc1erosis，AS）是指在動(dòng)脈及其分支的動(dòng)脈壁內(nèi)膜及內(nèi)膜下有脂質(zhì)沉著，同時(shí)伴有中層平滑肌細(xì)胞移行至內(nèi)膜下并增殖，導(dǎo)致內(nèi)膜增厚，形成黃色或灰黃色狀如粥樣物質(zhì)的斑塊，引起動(dòng)脈壁增厚、變硬、失去彈性，終致管腔狹窄[1,2]。AS是冠心病的主要病理改變，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)AS斑塊病理演變過程的認(rèn)識(shí)為中醫(yī)學(xué)與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)結(jié)合防治AS提供了一個(gè)很好的切入點(diǎn)，也為中醫(yī)藥治療AS的研究拓寬思路?；匦牟萦址Q太陽草、石菊、鐵腳一把傘,《中藥大辭典》記載其為苔蘚科植物紅大葉蘚（Rhodobryum roseum Limpr）的干燥或新鮮全草[3]?！对颇现胁菟庍x》、《云南思茅草藥選》、《森林藥物資源學(xué)》、《云南中藥資源名錄》、《德宏民族藥志》中均對(duì)其進(jìn)行了收錄。近期藥理研究表明，本品具有較為顯著的抗心肌缺血、低氧，擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，改善血液流變學(xué)，抗動(dòng)脈粥樣硬化及減輕內(nèi)皮細(xì)胞受損等作用[4?6]。本研究應(yīng)用回心草提取液干預(yù)兔AS斑塊和心肌梗死雙模型，同步觀察回心草提取液對(duì)兔AS斑塊和缺血心肌中血管新生的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

大耳白家兔，體質(zhì)量1.8～2.2kg，雌雄各半[南京金陵種兔場，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK（蘇）2012?0003；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK（蘇）2007?0017]。

1.2 主要儀器和試劑

Sartorius電子天平，德國Sartorius公司；奧林帕斯DX45顯微鏡，相機(jī)：DP72；OLYMPUS AU5400全自動(dòng)生化分析儀；CD34及VEGFR-2抗體（南京恩晶生物科技有限公司）。

1.3 藥物制備

稱取1000g回心草藥材，加相當(dāng)于藥材量的20倍冷水浸泡30min，加熱回流提取2次，每次2h，過濾，合并濾液，濃縮至1000ml，加95％的乙醇2000ml，配成75%的濃度，沉淀24h，抽濾，取濾液，回收乙醇，加蒸餾水配至1g/ml，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 模型制作與分組

30只兔隨機(jī)分成3組，其中普通飼料正常對(duì)照組10只（簡稱對(duì)照組），高脂飼料組10只（簡稱高脂組），高脂飼料加回心草藥物干預(yù)組10只（簡稱干預(yù)組）。高脂飼料配方為每1000g飼料含普通飼料830g，膽固醇粉20g，豬油50g，蛋黃粉100g。干預(yù)組家兔每天用回心草提取液10ml灌胃（相當(dāng)于生藥10g），而對(duì)照組及高脂組給予等量蒸餾水灌胃，共喂養(yǎng)9周。第9周末，采用開胸結(jié)扎兔冠狀動(dòng)脈左前降支（left anterior descending artery，LAD）的方法建立兔急性心肌梗死模型。靜脈麻醉后，將兔仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，常規(guī)消毒，于胸骨左緣第2～4肋間斷肋，暴露縱隔及心臟，提起左心耳，距主動(dòng)脈根部冠脈開口3mm以及5mm處雙重結(jié)扎LAD，觀察到所結(jié)扎血管供血區(qū)域心肌顏色變暗，心電圖胸前兩個(gè)導(dǎo)聯(lián)ST段抬高，判定模型建立成功，隨后關(guān)閉胸腔。

1.5 血脂檢測(cè)

于第9周末實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)，在家兔耳緣靜脈處抽血2ml置枸緣酸抗凝管中，靜置30min后，離心取血漿，采用酶法測(cè)定肌鈣蛋白I（troponin I，TnI）肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzyme，CK-MB）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglycerides，TG）和低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）。

1.6 病理組織學(xué)檢查

實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)，動(dòng)脈標(biāo)本取材，胸主動(dòng)脈橫截分段液氮保存，剩余動(dòng)脈置入10%中性甲醛液中，保存固定24h。其中取主動(dòng)脈弓血管，縱向剖開，用Herxheimers液[蘇丹Ⅲ（g）∶70%乙醇（ml）∶丙酮（ml）＝1∶100∶100]對(duì)主動(dòng)脈弓行大體染色20min，數(shù)碼相機(jī)照相，應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)測(cè)量斑塊面積、血管總面積，計(jì)算斑塊面積百分比。心臟標(biāo)本取材，將心臟短軸水平橫切，在梗死邊緣區(qū)切取組織標(biāo)本，一部分放入液氮保存，另一部分放入10%中性甲醛液中固定24h。對(duì)血管及心臟做病理組織學(xué)檢查，常規(guī)石蠟包埋，常規(guī)脫蠟后，每個(gè)組織塊以5μm厚度切片，HE染色，病理專業(yè)人員閱片，根據(jù)病變輕重程度，依次以“±”，“1＋”，“2＋”，“3＋”，“4＋”為半定量標(biāo)記，分別代表病變嚴(yán)重程度，依次為輕微、輕度、中度、重度、極重度，無病變?yōu)椤?”。采用EnVision法行分化抗原簇34（cluster of differentiation 34，CD34）及血管內(nèi)皮生長因子受體（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）免疫組化染色，在200倍光鏡視野下，隨機(jī)選擇背景和陽性組織區(qū)域各5處，應(yīng)用彩色病理圖文分析系統(tǒng)，分別測(cè)量其灰度值，計(jì)算陽性組織相對(duì)灰度值＝陽性組織灰度值/背景灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組家兔血清生化指標(biāo)的測(cè)定

從表1可見，高脂組、干預(yù)組與對(duì)照組比較，TC、TG、LDL-C明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01），提示家兔飼喂高脂飲食后出現(xiàn)典型的高血脂生化改變；高脂組、干預(yù)組CK-MB、TnI較對(duì)照組明顯升高（＜0.01），提示冠狀動(dòng)脈結(jié)扎造模后，心肌出現(xiàn)明顯的缺血損傷狀態(tài)。

干預(yù)組與高脂組比較，TC、TG明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01），LDL-C下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05），提示回心草對(duì)家兔高脂飼料飲食所致的高血脂具有明顯的防治作用。干預(yù)組CK-MB、TnI較高脂組明顯降低（＜0.01），提示回心草對(duì)冠狀動(dòng)脈結(jié)扎引起的心肌缺血損傷具有一定的防治作用。

2.2 病理學(xué)檢查

蘇丹Ⅲ染色后測(cè)量斑塊面積、血管總面積，計(jì)算斑塊面積百分比＝斑塊面積/血管總面積。高脂組管腔內(nèi)斑塊面積（83.29±5.87）%較對(duì)照組（5.35±0.93）%明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01；圖1）。

對(duì)照組心臟的心肌細(xì)胞橫紋清晰，無嗜酸變性、無空泡變性，心肌細(xì)胞無壞死。間充質(zhì)無充血、水腫，無炎細(xì)胞浸潤。各室壁肌纖維間（冠狀動(dòng)脈分支壁）內(nèi)無脂質(zhì)沉積，管壁無增厚等動(dòng)脈硬化性病變。各部位心肌細(xì)胞未見明顯病變。心壁內(nèi)心肌纖維間冠狀動(dòng)脈分支未見明顯病變。主動(dòng)脈壁由內(nèi)膜、中膜和外膜組成，內(nèi)膜襯覆有單層扁平上皮，內(nèi)膜下可見內(nèi)彈力層。中膜主要由彈性纖維組成，其間有少量基質(zhì)。外膜為結(jié)締組織和脂肪。內(nèi)皮細(xì)胞無腫脹、增生，管腔平滑。管壁基質(zhì)無增多。內(nèi)膜和管壁未見泡沫細(xì)胞（圖2A，2A￠）。

圖1 蘇丹Ⅲ染色后的對(duì)照組動(dòng)脈硬化斑塊（A）與高脂組動(dòng)脈硬化斑塊（B）

Figure 1 The atherosclerotic plaques of the control group (A) and high fat group (B) after Sultan Ⅲ staining

高脂組的病理改變，主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞嗜酸變性和空泡變性。嗜酸變性的心肌細(xì)胞表現(xiàn)為肌漿伊紅深染，細(xì)胞核體積變小、固縮狀。空泡變性表現(xiàn)為心肌細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大小不一、形態(tài)較規(guī)則的空泡。心肌細(xì)胞體積較正常小，縱切面變細(xì)，呈萎縮的形態(tài)學(xué)改變。心肌間充質(zhì)少量炎細(xì)胞浸潤和組織細(xì)胞增生。心壁內(nèi)心肌纖維間小冠狀動(dòng)脈分支管壁增厚，內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，管壁內(nèi)泡沫細(xì)胞增生，管腔較正常小，呈動(dòng)脈硬化性形態(tài)學(xué)改變。主動(dòng)脈壁內(nèi)有脂質(zhì)沉積，主動(dòng)脈內(nèi)膜基質(zhì)增多，內(nèi)膜不規(guī)則，內(nèi)膜下有明顯的泡沫細(xì)胞局部積聚（圖2B，2B￠）。

干預(yù)組心肌細(xì)胞輕度嗜酸變性伴空泡變性，局部個(gè)別心肌纖維壞死，心肌間充質(zhì)見小灶炎細(xì)胞浸潤和組織細(xì)胞增生。主動(dòng)脈壁輕度泡沫細(xì)胞增生（圖2C，2C￠）。

表1 3組家兔血清生化指標(biāo)的比較

CK-MB: creatine kinase isoenzyme; TnI: troponin I; TC: total cholesterol; TG: triglycerides; LDL-C: low-density lipoprotein cholesterol. Compared with control group,**＜0.01; compared with high fat group,#＜0.05,##＜0.01

圖2 3組家兔心肌細(xì)胞和主動(dòng)脈細(xì)胞

Figure 2 Myocardium and aorta cells in three groups (HE ×200) A: myocardium in control group. A ventricular myocardial fiber longitudinal section. Myocardial cell volume is normal, without acidophilicdegeneration, vacuolar degeneration or necrosis. Intramyocardial coronary vessel structure is normal, with morphological changes in reactive sclerosis. A￠: aorta cells in the control group. Aortic endothelial cell displays no swelling or hyperplasia. Aorta intima is smooth and regulatory. No increase in wall matrix and no foam cell are observed. B: myocardium in high fat group. Regional myocardial cells show vacuolated andacidophilic degeneration. Myocardial interstitial inflammatory cell infiltration is observed. Compared with the normal control, the coronary vascular branch has smaller lumen. B￠: aorta cells in high fat group. Aortic endothelial cells swell and proliferate. Aortic membrane is not smooth. The aortic wall matrix increase. Subintima foam cells proliferate. C: myocardium in intervention group. Myocardial cells display acidophilic degeneration and mild vacuolar degeneration. C￠: aorta cells in intervention group. The aortic wall with increased matrix. A small amount of foam cells are observed in the aortic wall and subintima

高脂組與對(duì)照組病理評(píng)分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（6.13±1.64）（0.05±0.01），＜0.01]。干預(yù)組的病理改變介于對(duì)照組和高脂組之間，干預(yù)組與對(duì)照組比較，病理評(píng)分差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（3.75±0.46）（0.05±0.01），＜0.05]；干預(yù)組與高脂組比較，病理評(píng)分差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（3.75±0.46）（6.13±1.64），＜0.01]。

2.3 免疫組化染色

采用免疫組化染色家兔心臟組織，各組CD34與VEGFR2蛋白表達(dá)結(jié)果見表2。高脂組CD34及VEGFR2表達(dá)水平與對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）；干預(yù)組CD34及VEGFR2表達(dá)水平分別與對(duì)照組及高脂組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）。各組典型免疫組織化學(xué)照片見圖3。

3 討 論

血脂檢測(cè)是評(píng)價(jià)AS病變的一個(gè)公認(rèn)、必不可少的指標(biāo)。高血脂水平是AS動(dòng)物模型成功建立的評(píng)判依據(jù)之一。高脂血癥與AS的關(guān)系已經(jīng)得到證實(shí)，血漿膽固醇水平與AS的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。尤其是LDL-C能在血漿內(nèi)或動(dòng)脈內(nèi)膜下，經(jīng)自由基引發(fā)的脂質(zhì)過氧化，轉(zhuǎn)變成氧化修飾LDL（ox-LDL），它在AS發(fā)生、發(fā)展及斑塊形成過程中有至關(guān)重要的作用。兔是食草動(dòng)物，很難自發(fā)形成AS，但是對(duì)高脂飼料敏感，吸收率高達(dá)75%～90%，且對(duì)高血脂清除能力低，在短期內(nèi)即可誘發(fā)明顯病變，是制作AS模型的常用動(dòng)物。它具有成本較低、操作方便，并且其脂代謝與人類有相似之處，同時(shí)在停止高脂飲食飼養(yǎng)后，該動(dòng)物模型在一定時(shí)間內(nèi)能保持穩(wěn)定的特點(diǎn)[7?9]。本研究血脂測(cè)定結(jié)果顯示，高脂組家兔血脂水平（TC、LDL-C、TG）與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01），提示家兔飼喂高脂飲食后出現(xiàn)了高脂血癥，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。干預(yù)組與高脂組比較，TC、TG、CK-MB、TnI明顯下降（＜0.01），提示回心草不但對(duì)家兔高脂飼料飲食所致的高脂血癥具有一定的防治作用，而且對(duì)冠狀動(dòng)脈結(jié)扎引起的心肌缺血損傷具有一定的保護(hù)作用。

表2 3組CD34和VEGFR2表達(dá)水平的比較

CD34: cluster of differentiation 34; VEGFR2: vascular endothelial growth factor receptor 2. Compared with control group,*＜0.05,**＜0.01; compared with high fat group,#＜0.05

病理學(xué)檢測(cè)是評(píng)價(jià)AS造模成功的重要指標(biāo)。本文病理學(xué)檢查表明（圖1，圖2），在高脂組家兔動(dòng)物模型中，主要表現(xiàn)為主動(dòng)脈壁內(nèi)有脂質(zhì)沉積，中膜平滑基層變薄、內(nèi)膜增厚、巨噬細(xì)胞的侵入和內(nèi)彈力層破壞等，其動(dòng)脈局部病理特點(diǎn)與人類動(dòng)脈粥樣硬化病理特點(diǎn)已非常相似，能滿足實(shí)驗(yàn)研究的需要。心肌細(xì)胞嗜酸變性和空泡變性，心壁內(nèi)冠狀動(dòng)脈分支早期內(nèi)皮細(xì)胞增生、腫脹，管壁明顯增厚，正常結(jié)構(gòu)消失，管腔極度縮小，呈硬化性改變。故通過高脂飼養(yǎng)的方法，可在較短時(shí)期內(nèi)成功復(fù)制出穩(wěn)定可靠的AS兔模型。采用開胸結(jié)扎兔冠狀動(dòng)脈LAD的方法建立兔急性心肌梗死模型[10,11]，胸膜保持完好，動(dòng)物自主呼吸，低位雙重結(jié)扎，成功率高。干預(yù)組的病理評(píng)分較對(duì)照組高，較高脂組低（＜0.05）。提示回心草減緩了AS的發(fā)生和減輕了心肌組織的缺血壞死。

圖3 3組家兔CD34和VEGFR2表達(dá)的檢測(cè)

Figure 3 Expression of CD34 and VEGFR2 in three groups (EnVision, ×200) CD34: cluster of differentiation 34; VEGFR2: vascular endothelial growth factor receptor 2; A, A￠: control group; B, B￠: high fat group; C, C￠: intervention group

在AS的進(jìn)展過程中，血管新生是一個(gè)重要的伴隨現(xiàn)象，在促進(jìn)側(cè)支形成和抑制AS的治療策略中，存在著固有的相互制約，必須綜合考慮并兼顧這對(duì)矛盾的平衡[12,13]。Janus現(xiàn)象提示[14,15]，當(dāng)一項(xiàng)干預(yù)措施有利于側(cè)支形成時(shí)，它也可能具有促進(jìn)AS的作用；當(dāng)一項(xiàng)干預(yù)措施具有抗AS作用時(shí)，它同樣也有可能抑制側(cè)支形成。臨床上采用促血管新生或抗AS的治療措施時(shí)，必須考慮到Janus現(xiàn)象的存在。CD34及VEGFR2能促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，參與血管新生。本研究發(fā)現(xiàn)，高脂組家兔心肌組織CD34和VEGFR2陽性組織相對(duì)灰度值均明顯高于對(duì)照組（＜0.01），而回心草干預(yù)組這兩者表達(dá)水平較對(duì)照組高、較高脂組低（＜0.05）。提示高脂飼養(yǎng)促進(jìn)了家兔心肌組織CD34和VEGFR2的表達(dá)，而回心草抑制了這兩者的表達(dá)，不僅減緩AS的進(jìn)程，也對(duì)缺血心肌的血管新生產(chǎn)生了影響。

綜上所述，我們通過高脂飼養(yǎng)和開胸結(jié)扎兔冠狀動(dòng)脈LAD的方法，成功建立家兔AS和急性心肌梗死雙模型。并在實(shí)驗(yàn)中觀察到回心草提取液減輕了AS和心肌缺血壞死，抑制了心肌組織CD34和VEGFR2的表達(dá)，影響了缺血心肌的血管新生。

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（編輯: 李菁竹）

Effect ofLimpr. on atherosclerosis and ischemic myocardial angiogenesis in rabbits

XIAO Ji-Ming, WAN Wen-Hui, XU Jun*

(Department of Cardiology, Nanjing General Hospital, Nanjing Military Command, Nanjing 210002, China)

To establish a rabbit model of atherosclerosis (AS) and acute myocardial infarction (AMI), and then to determine the effect of the extracts ofLimpr., a Chinese herbal medicine on the rabbit AS and ischemic myocardial angiogenesis.A total of 30 white rabbits were randomly and equally divided into 3 groups, that is, normal control group (fed with the full diet), high-fat feed group andintervention group (fed with high fat diet and intra-gastric injection of the extract). At the end of the 9 weeks’ feeding, AMI was inflicted by opening chest and ligating the left anterior descending artery (LAD). At the end of experiment, the blood biochemical indicators were determined, and blood vessels and heart tissue were collected for pathological observation. Immunohistochemical staining was used to detect the expression of the cluster of differentiation 34 (CD34) and vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2) in the myocardium.Compared with the control group, the high-fat group and the intervention group had significantly increased creatine kinase isoenzyme (CK-MB), troponin I (TnI), total cholesterol (TC), triglycerides (TG), and low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C) (＜0.01). The serum levels of TC, TG, CK-MB and TnI were very significantly decreased (＜0.01), and that of LDL-C was obviously reduced (＜0.05) in the intervention group than in the high-fat group. The pathological grade was very significantly higher in the high-fat group than in the control group (＜0.01), and the grade of the intervention group was between those of the former groups (＜0.05). CD34 and VEGFR2 were significantly expressed with stronger positive intensity in the high-fat group than in the control group (＜0.01). Their expression levels in the intervention group were obviously lower than those of high fat group but higher than those of the control group (＜0.05).High fat feeding for 9 weeks and ligating LAD artery can successfully establish a rabbit model of AS and AMI. The extract ofattenuates AS and myocardial ischemic necrosis and inhibits the expression of CD34 and VEGFR2 in the myocardium.

Limpr; atherosclerosis; myocardial infarction; angiogenesis

R543.5; R542.22

A

10.3724/SP.J.1264.2014.000213

2014?09?05;

2014?10?13

南京軍區(qū)南京總醫(yī)院課題基金資助項(xiàng)目（2013063）

徐 軍, E-mail: 1974xjm@sohu.com