短時(shí)受精聯(lián)合早期補(bǔ)救性卵胞質(zhì)內(nèi)單精子注射在重度畸形精子癥患者中的臨床應(yīng)用

乜照燕吳海峰甄秀麗張 娜郭麗娜趙素英呂翠婷

1. 河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院（石家莊 050011）；2. 河北省胸科醫(yī)院

短時(shí)受精聯(lián)合早期補(bǔ)救性卵胞質(zhì)內(nèi)單精子注射在重度畸形精子癥患者中的臨床應(yīng)用

乜照燕1*吳海峰2甄秀麗1張 娜1郭麗娜1趙素英1呂翠婷1

1. 河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院（石家莊 050011）；2. 河北省胸科醫(yī)院

目的評(píng)估短時(shí)受精聯(lián)合早期補(bǔ)救性卵胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）術(shù)在重度畸形精子癥患者中的臨床應(yīng)用。方法 235例重度畸形精子癥患者（1%≤精子正常形態(tài)率＜5%）行體外受精-胚胎移植（IVF-ET）周期隨機(jī)分組， 101例直接實(shí)施ICSI為A組，134例實(shí)施短時(shí)受精聯(lián)合早期補(bǔ)救性ICSI為B組，短時(shí)受精后4～5h行極體觀察，其中109例大于30%可見雙極體列為B1組， 25例早期判斷未見雙極體或小于30%未見雙極體行早期補(bǔ)救性ICSI術(shù)列為B2組。比較不同組受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、胚胎種植率及臨床結(jié)局。結(jié)果3 組的卵子成熟率分別為83.93%，87.03%和90.48%，正常受精率分別為78.76%，72.49%和75.61%，異常受精率分別為6.11%，14.88%和9.76%，卵裂率分別為83.93%，85.89%和84.96%，優(yōu)質(zhì)胚胎率分別為49.45%，50.49%和53.23%，胚胎植入率分別為28.10%，26.67%和32.00%，臨床妊娠率分別為43.66%，43.04%和47.62%，流產(chǎn)率分別為6.45%，8.82%和10.00%。3 組的卵子成熟率、正常受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、胚胎種植率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），異常受精率在B1組有增高趨勢(shì)，與其它組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論短時(shí)受精聯(lián)合早期補(bǔ)救性ICSI在重度畸形精子癥患者有應(yīng)用價(jià)值，可以最大限度的減少ICSI比率，獲得好的臨床結(jié)局。

精子/畸形; 卵胞漿內(nèi)單精子注射, 男性不育; 受精

在不孕夫婦中，男方因素所占比例為40%左右。精液分析是評(píng)估男性生育能力的最客觀和最直接的重要手段， 精子形態(tài)比精液其它參數(shù)更能體現(xiàn)男性生育價(jià)值， 在男性不育中約50% 存在精子形態(tài)異常。但目前有關(guān)精子形態(tài)的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)和它在體外受精中所起的作用一直存在爭(zhēng)議。2010 年WHO出版了第五版《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，新版手冊(cè)修訂最明顯的內(nèi)容之一是精子形態(tài)學(xué)的判讀標(biāo)準(zhǔn)和正常參考值，將精子形態(tài)4%認(rèn)為正常參考值[1]，這也引起巨大爭(zhēng)議，精子形態(tài)是影響受精的重要因素之一[2,3]，一般認(rèn)為正常形態(tài)精子＜15%體外受精能力下降。嚴(yán)重畸形精子癥一直被認(rèn)為是卵胞漿內(nèi)單精子注射（intracytoplasmic sperm injection, ICSI）的治療指征[4]，然而一些臨床實(shí)踐表明ICSI并不是嚴(yán)重畸形精子癥唯一最佳助孕方式[5,6]，嚴(yán)重畸形精子行ICSI需要重新審視，如何防范受精失敗和嚴(yán)格控制ICSI 技術(shù)指征引起了生殖醫(yī)學(xué)工作者的廣泛關(guān)注。隨著早補(bǔ)救ICSI的應(yīng)用，為重度畸形精子癥患者實(shí)施常規(guī)IVF提供了保證，本研究擬對(duì)重度畸形精子癥患者采用短時(shí)受精結(jié)合早期補(bǔ)救性ICSI 技術(shù)，對(duì)重度畸形精子癥患者授精方式進(jìn)行評(píng)估。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

接受常規(guī)體外受精-胚胎移植（IVF-ET）治療的235對(duì)重度畸形精子癥（1%≤精子正常形態(tài)率＜5%）夫婦。極度畸形精子癥患者即精子正常形態(tài)＜1%直接實(shí)施ICSI不在本研究范圍，為排除女性不孕因素對(duì)卵子質(zhì)量、受精、著床等的影響，以年齡＜35歲、基礎(chǔ)卵泡生成素（FSH）水平≤10 mlU/mL、基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)≥10個(gè)為入組條件。排除標(biāo)準(zhǔn)為：多囊卵巢綜合征、子宮內(nèi)膜異位癥或子宮畸形等。男方年齡23～37歲，女方年齡22～34歲。不孕年限l～10年。101例直接實(shí)施ICSI列為A組；134例實(shí)施短時(shí)受精聯(lián)合早期補(bǔ)救性ICSI列為B組，短時(shí)受精后4～5h行極體觀察，其中109例大于30%可見雙極體列為B1組， 25例早期判斷未見雙極體或小于30%未見雙極體行補(bǔ)救性ICSI術(shù)列為B2組。

二、研究方法

（一）精液常規(guī)檢查

精液液化后按照《WHO人類精液及精子-宮頸黏液相互作用實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)手冊(cè)》(第五版)要求行精液常規(guī)檢查。

（二）精子形態(tài)學(xué)分析

采用Diff-Quick快速染色法染色，遵照新版手冊(cè)的嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)，只有帶有尾部的可辨認(rèn)精子才考慮進(jìn)行精子計(jì)數(shù)，且所有形態(tài)處于臨界狀態(tài)的精子均列為異常， 每張涂片計(jì)數(shù)兩次， 每次計(jì)數(shù)200條精子， 計(jì)算精子正常形態(tài)率。如兩次計(jì)數(shù)的差值在可接受的范圍內(nèi)，則取兩次計(jì)數(shù)的均值； 若兩次計(jì)數(shù)的差值超出可接受的范圍， 則重新涂片計(jì)數(shù)。

（三）控制性促排卵

采用長(zhǎng)方案控制性超排卵，于排卵后第7天給予醋酸曲普瑞林0.1mg（商品名：達(dá)必佳，0.1mg/支，德國(guó)輝凌制藥有限公司，注冊(cè)證號(hào)：H20100365）皮下注射，第14天左右給予注射用重組人促卵泡激素 150-225IU（商品名：果納芬，75IU/支，瑞士默克雪蘭諾有限公司，注冊(cè)證號(hào)：S20080030）啟動(dòng)促排卵，當(dāng)主導(dǎo)卵泡中有1個(gè)直徑達(dá)18 mm或2個(gè)達(dá)17 mm或3個(gè)達(dá)16mm，雌激素達(dá)到每個(gè)卵泡約200～300 pg/ mL，給予注射用重組人絨促性激250μg（商品名：艾澤，250μg /支，瑞士默克雪蘭諾有限公司，注冊(cè)證號(hào)：S20110045），36～37 h后取卵。

（四）短時(shí)受精

A組按以前標(biāo)準(zhǔn)直接行ICSI，取卵后卵子體外成熟培養(yǎng)3～4h 剝除卵周顆粒細(xì)胞后行ICSI，B組獲取的卵細(xì)胞體外培養(yǎng)3～4 h 按4～5萬(wàn)精子/卵細(xì)胞的比例加入精子，卵細(xì)胞與精子共孵育4 h后，用拉細(xì)的巴氏吸管輕輕吹打卵丘復(fù)合物，除盡卵母細(xì)胞周圍的卵丘細(xì)胞，置于新鮮培養(yǎng)液微滴中，觀察第二極體出現(xiàn)情況，大于30%MⅡ見第二極體列為B1組，全部MⅡ卵子或小于30%MⅡ卵子未見第二極體則受精5h 后再次觀察，仍未發(fā)現(xiàn)全部MⅡ卵子或小于30%MⅡ卵子未見第二極體立即行早期補(bǔ)救性ICSI列為B2組。

（五）受精觀察胚胎評(píng)估及移植

受精及胚胎培養(yǎng)在恒溫倒置鏡下觀察受精情況，以出現(xiàn)兩原核作為正常受精標(biāo)志。將正常受精的合子移入新鮮的培養(yǎng)液微滴中繼續(xù)培養(yǎng)，并在授精后48h 及72h 觀察胚胎發(fā)育情況。并評(píng)定胚胎質(zhì)量。優(yōu)質(zhì)胚胎標(biāo)準(zhǔn)：第3天胚胎細(xì)胞數(shù)≥6個(gè)，碎片≤20%。

（六）胚胎移植與黃體支持

選擇優(yōu)質(zhì)胚胎移植，移植胚胎數(shù)≤3 個(gè)，剩余Ⅱ級(jí)以上胚胎冷凍保存，并同時(shí)給予黃體支持。移植術(shù)后第14天測(cè)血β-hCG 陽(yáng)性， 35d B 超觀察宮腔內(nèi)孕囊數(shù)和心管搏動(dòng)確定臨床妊娠。

（七）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、三組患者女方基本情況比較

三組患者在女方年齡、不孕年限、體重指數(shù)、基礎(chǔ)FSH水平、基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)等方面的差異無(wú)顯著性（P均＞0.05），見表1

表1 三組患者女方基本情況比較

表2 三組患者控制性超排卵情況比較

二、三組患者控制性超排卵情況比較

在控制性超排卵中，三組患者Gn天數(shù)、Gn用量、HCG日E2水平、HCG日子宮內(nèi)膜厚度、平均獲卵數(shù)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2

三、三組患者精液分析情況比較

三組精液量、精子密度、精子活動(dòng)率、前向運(yùn)動(dòng)精子百分率、精子正常形態(tài)百分率均無(wú)顯著性差異（P均＞0.05），見表3

表3 三組精液分析情況比較

四、三組畸形精子癥患者體外受精結(jié)局的比較

三組患者受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、植入率、妊娠率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。B1組異常受精率有增高趨勢(shì)，與其他兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），見表4

表4 三組畸形精子癥患者體外受精結(jié)局的比較

討 論

ICSI 是在體外顯微鏡下將單個(gè)精子直接注入成熟卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)，使精、卵結(jié)合的一種顯微操作技術(shù)。該技術(shù)主要應(yīng)用于男性因素不育， 成為男性嚴(yán)重少弱精子癥、畸形精子癥及阻塞性無(wú)精子癥的有效治療方法。Kruger等[7]首先提出嚴(yán)格的形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)分類用來(lái)評(píng)估精子質(zhì)量，新版 WHO5 評(píng)估精子并用于指導(dǎo)輔助生育治療對(duì)形態(tài)學(xué)的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)更為嚴(yán)格，形態(tài)正常精子百分率的參考值范圍由WHO4 的15%下降到WHO5 的4%。精子形態(tài)是衡量精子質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。常規(guī)IVF周期中，精子形態(tài)可影響受精率[8]，正常形態(tài)精子＜5%被認(rèn)為是重度畸形精子癥列入ICSI助孕指征，ICSI對(duì)精子的選擇基于精子活力和大體形態(tài)，越過了自然選擇過程，克服了精子形態(tài)缺陷導(dǎo)致的受精失敗，使精、卵人為地“結(jié)合”到了一起，但可能會(huì)介入受損的父代基因[9,10]或?qū)е掠≯E基因的損傷[11]，有研究證實(shí)ICSI有可能通過對(duì)雄原核H3K9雙甲基化的影響進(jìn)而影響胚胎生長(zhǎng)發(fā)育[12]。ICSI 的介入性操作存在安全隱患，充分給予患者精卵自然結(jié)合的受孕機(jī)會(huì)，預(yù)防和避免重度畸形精子癥受精失敗成為改善某些IVF結(jié)局的重要環(huán)節(jié)，為此尋找受精的最早期證據(jù)非常重要。Chen等[13]加入精子后6 h 通過觀察第二極體的釋放確定受精與否，受精失敗即行早期補(bǔ)救，獲得了高妊娠率，短時(shí)受精結(jié)合補(bǔ)救ICSI，可成為預(yù)防受精失敗的有效方法[14,15]。補(bǔ)救性ICSI的出現(xiàn)為盡早挽救可能受精失敗的卵子提供了可能，同時(shí)又盡可能的避免了ICSI過度應(yīng)用時(shí)人為選擇精子的弊端。本研究評(píng)估了短時(shí)受精聯(lián)合早期補(bǔ)救性ICSI在重度畸形精子癥患者中的臨床應(yīng)用，結(jié)果如下。

夫婦雙方的年齡， 不孕年限以及女方控制性超排卵情況可影響受精率、胚胎質(zhì)量、妊娠結(jié)局。故本研究對(duì)入組病例的一般情況和控制性超排卵進(jìn)行比較，三組的之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0. 05）。

本研究結(jié)果顯示，實(shí)施早補(bǔ)救組25例，其中原發(fā)不孕16例，繼發(fā)不孕9例，比較三組間受精率結(jié)果顯示，正常受精率和異常受精率結(jié)果均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）， B1 組的異常受精率（14.88%）略高于B2組（9.76%）和A組（6.11%），進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，短時(shí)受精的3PN 率明顯升高，可能原因?yàn)槎虝r(shí)受精過早去除卵丘細(xì)胞，使卵母細(xì)胞與周圍的卵丘細(xì)胞及其分泌因子分離，脫離了卵丘細(xì)胞存在的微環(huán)境，使多精受精的發(fā)生增加；去除卵丘細(xì)胞機(jī)械刺激可能會(huì)損傷卵母細(xì)胞，增加多精入卵的機(jī)會(huì)；為達(dá)到改善畸形精子癥患者受精率的目的增加精子受精濃度。

優(yōu)質(zhì)胚胎率方面，三組間結(jié)果均無(wú)顯著性差異（P＞0. 05），體外受精中，胚胎質(zhì)量更多地取決于卵母細(xì)胞的質(zhì)量，卵齡對(duì)卵母細(xì)胞的質(zhì)量有直接影響，隨著卵母細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞漿和細(xì)胞核過度成熟，卵子質(zhì)量退化，卵子老化程度加劇，從而影響受精及胚胎發(fā)育的潛能[16]。因此盡早發(fā)現(xiàn)受精失敗并行補(bǔ)救非常重要。本研究的結(jié)果顯示如果該患者的卵子不存在受精障礙，40%左右的卵子會(huì)在授精后4h排出第二極體， 80%的卵子會(huì)在授精后5h排出第二極體。在觀察過程中，若極體邊界不清晰，需輕輕撥動(dòng)卵子，微調(diào)體視鏡焦距，直至能清晰觀察；若兩個(gè)極體體積差別較小，只要邊界清晰可見，優(yōu)先考慮觀察到的是第二極體；若兩個(gè)可疑極體體積差別較大甚至數(shù)倍，則需要考慮是否是卵周間隙碎片樣雜質(zhì)；若極難判斷是否是第二極體或極體破碎、形態(tài)異常需要延長(zhǎng)觀察時(shí)間、結(jié)合胞漿情況以及極體是否有位置變化來(lái)判斷。早期受精的判斷時(shí)機(jī)、判斷依據(jù)以及早期失敗補(bǔ)救標(biāo)準(zhǔn)的確立，將有助于該類患者胚胎結(jié)局的改善。

在臨床結(jié)局的著床率、妊娠率、流產(chǎn)率三組間結(jié)果均無(wú)顯著性差異（P＞0. 05），但有研究顯示，早期補(bǔ)救ICSI 結(jié)局雖然優(yōu)于晚時(shí)補(bǔ)救ICSI，但與常規(guī)IVF 相比有一定差距，表明卵母細(xì)胞最佳受精窗口可能比所估計(jì)的時(shí)間還要短或者有其他影響受精的原因，進(jìn)而影響胚胎發(fā)育及妊娠結(jié)局[17]。本研究例數(shù)極少，未發(fā)現(xiàn)臨床結(jié)局方面的差異，需擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步研究。

總的來(lái)說(shuō)，對(duì)于重度畸形精子癥患者精子密度及活力達(dá)到常規(guī)IVF 要求，選擇常規(guī)IVF 治療是可行的，對(duì)于受精失敗者，即刻行早期補(bǔ)救ICSI，也可獲得滿意的妊娠結(jié)局，既避免了ICSI 選擇的擴(kuò)大化、也避免了常規(guī)IVF-ET受精失敗的擔(dān)憂。重新審視嚴(yán)重畸形精子受精方式，充分給予患者精卵自然結(jié)合的受孕機(jī)會(huì)，嚴(yán)格控制異常形態(tài)精子行ICSI治療指征，對(duì)避免異常遺傳基因的傳遞、提高輔助生殖技術(shù)的安全性有積極的意義。

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（2013-10-25收稿）

Clinical application of short-period fertilization and early rescue intracytoplasmic sperm injection in the fertilization of severe teratozoospermia

Nie Zhaoyan1*, Wu Haifeng2, Zhen Xiuli1, Zhang Na1, Guo Lina1, Zhao SuYing1, Lv Cuiting1
1. The Fourth Affi liated Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang, Hebei 050011, China; 2. Chest Hospital of Hebei Province Corresponding author: Nie Zhaoyan, E- mail: niezhaoyan@163.com

ObjectiveTo evaluate clinical application of short-period fertilization combined with early rescue intracytoplasmic sperm injection (ICSI) technique in fertilization of severe abnormal sperm.MethodsTotal 235 patients with severe teratozoospermia （1%≤Normal sperm morphology rate＜5%）for in vitro fertilization-embryo transfer (IVF-ET) cycles for egg were randomly divided into two groups. 101 cases of direct implementation of the ICSI as group A, 134 cases for short-period fertilization combined with early rescue ICSI as group B. Among group B, cumulus cells were removed after fertilization 4～5h, second polar body of oocytes was observed, in which 109 cases more than 30% visible bipolar body as B1 group, 25 cases of early judgment no less than 30% of bipolar body performed early remedial ICSI surgery as a group B2.The fertilization rate, cleavage rate, high-quality embryo rate, implantation rate and clinical outcome were comparatively analyzed among different groups.Results Egg maturation rates of three groups were 83.93%, 87.03% and 90.48% respectively, normal fertilization rates were 78.76%, 72.49% and 75.61%, abnormal fertilization rateswere 6.11%, 14.88% and 9.76%, cleavage rates were 83.93%, 85.89% and 84.96%, high-quality embryos were 49.45%, 50.49% and 53.23%, implantation rates were 28.10%, 26.67% and 32.00%, clinical pregnancy rates were 43.66%, 43.04% and 47.62%, miscarriage rates were 6.45%, 8.82% and 10.00%. there were no signifi cant difference in egg maturation rate, normal fertilization rate, cleavage rate , high-quality embryo rate, implantation rate, clinical pregnancy, miscarriage rates among three groups different (P>0.05). Abnormal fertilization rate in group B had an increasing trend, but the difference was not statistically signifi cant (P>0.05).Conclusion Short-period fertilization combined with early rescue Intracytoplasmic sperm injection (ICSI) show great value for fertilization of patients with severe abnormal sperm. A good clinical outcome can be obtained if minimizing the ICSI.

spermatozoa/abnormalities; intracytoplasmic sperm injection, male infertility; fertilization

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.01.007

R 321-33

*通訊作者, E-mail: niezhaoyan@163.com