谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因遺傳多態(tài)性與特發(fā)性男性不育癥相關(guān)性研究*

唐開發(fā)徐紹源鄒鐵軍丁上書劉睿智王新陽田 源孫 發(fā)**邢俊平**

1. 貴陽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科（貴陽 550004）;

2. 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科; 3. 陜西省人民醫(yī)院泌尿外科

·論 著·

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因遺傳多態(tài)性與特發(fā)性男性不育癥相關(guān)性研究*

唐開發(fā)1徐紹源2鄒鐵軍3丁上書2劉睿智2王新陽2田 源1孫 發(fā)1**邢俊平2**

1. 貴陽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科（貴陽 550004）;

2. 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科; 3. 陜西省人民醫(yī)院泌尿外科

目的該研究旨在探討谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因（GST）M1、T1及P1基因多態(tài)性與特發(fā)性男性不育癥的相關(guān)性。方法該病例-對照研究包括246例特發(fā)性少弱精子癥男性不育患者及117例正常健康有生育史男性對照。采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）方法分別對GSTM1、GSTT1和GSTP1基因進(jìn)行分型。結(jié)果GSTM1基因缺失型在正常對照組和特發(fā)性少弱精子癥不育患者組基因型頻率分別為41.88%和60.57%，具有顯著差異（P=0.001）；GST T1基因缺失型在正常對照組和特發(fā)性少弱精子癥不育患者組基因型頻率分別為47.86%和62.60%，具有顯著差異（P=0.008）；GSTM1/T1基因缺失型在正常對照組和特發(fā)性少弱精子癥不育患者組基因型頻率分別為14.53%和38.62%，具有顯著差異（P＜0.001）；GSTP1基因突變型在正常對照組和特發(fā)性少弱精子癥不育患者組基因型頻率分別為27.35%和32.11%，無明顯差異（P=0.847）。結(jié)論GSTM1、GSTT1基因缺失型分別是特發(fā)性男性不育癥的危險因素。GSTP1基因突變型與特發(fā)性男性不育癥患者無明顯相關(guān)性。

男性不育癥; 谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶; 多態(tài)性

男性不育癥（Male infertility）是指夫婦同居一年以上，未采取任何避孕措施，由于男性方面的原因?qū)е屡讲荒苁茉姓遊1]。其中有30%的男性不育癥患者未發(fā)現(xiàn)明確的致病原因，包括發(fā)病機(jī)制及病理生理過程均不清楚，故稱之為特發(fā)性男性不育癥（Idiopathic oligoasthezoonspermia）[2]，男性不育癥是多因素相互作用而引起的疾病，其發(fā)病機(jī)制包括遺傳因素和環(huán)境因素的相互作用。其中遺傳因素被認(rèn)為是導(dǎo)致人類生精功能損傷的重要因素，在特發(fā)性少弱精子癥男性不育患者中，約有60%被研究發(fā)現(xiàn)與遺傳因素有關(guān)[3]。

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（Glutathione S-transferases，GSTs）是一組具有解毒功能的蛋白超基因家族，屬于機(jī)體Ⅱ相解毒酶系統(tǒng)，其中編碼Mu，Theta和Pi亞型酶的GSTM1、GSTT1和GSTP1基因在人群中存在功能性基因遺傳多態(tài)性[4]。該研究旨在探討谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因GSTM1、T1及P1基因多態(tài)性與特發(fā)性男性不育癥的相關(guān)性。

資料與方法

一、材料

（一）研究對象

1. 納入標(biāo)準(zhǔn)：按WHO第四版[5]標(biāo)準(zhǔn)常規(guī)進(jìn)行2次或2次以上精液分析：睪丸體積在中國成人睪丸正常體積范圍（15～25mL）；精液量≥2.0mL，精子密度＜20×106/mL且＞5×106/mL，A級精子百分率＜25%且（A+B）級精子百分率＜50%；正常形態(tài)精子＞30%（一般標(biāo)準(zhǔn)），外周血染色體（G顯帶）均為46, XY；外周血清卵泡生成素（FSH）、黃體生成素（LH）、泌乳素（PRL）、睪酮（T）水平在正常值范圍；有規(guī)律性生活1年以上，未采取任何避孕措施女方未受孕；抗精子抗體檢測陰性。

2. 正常對照組標(biāo)準(zhǔn)：健康生育男性既往1年內(nèi)有生育史且目前性激素水平、精液分析等各項指標(biāo)檢查均未發(fā)現(xiàn)異常。

3. 排除標(biāo)準(zhǔn)：患者性生活異常，存在不射精或逆行射精等射精障礙；染色體異常、先天畸形、隱睪、睪丸發(fā)育不良、睪丸萎縮、損傷、精索靜脈曲張、性腺功能減退癥、白細(xì)胞精子癥、輸精管梗阻及生殖系統(tǒng)感染等；服用抗癲癇病、抗腫瘤、抗風(fēng)濕及抗類風(fēng)濕等有礙生精及精子活力的藥物者；排除合并心血管、肝、腎和造血系統(tǒng)等嚴(yán)重原發(fā)性疾病、代謝性疾病、精神病患者，吸煙（每天吸煙在10支以上，持續(xù)半年以上）及酗酒（每天酗酒50mL（純乙醇含量）以上，持續(xù)半年以上）者，以及患者本人或家屬不同意參加并未簽訂臨床研究協(xié)議者。通過以上納入及排除標(biāo)準(zhǔn)，共有246例患者及117例對照納入該項研究。

（二）主要試劑及儀器

全血基因組提取試劑盒購自美國Ax y ge n biosciences公司，2×PCR Mixture 購自立陶宛MBI公司。Biomltra梯度PCR儀為德國Sigma公司產(chǎn)品，凝膠成像分析系統(tǒng)為美國BioRad公司。

二、方法

（一）引物設(shè)計和合成

根據(jù)基因序列，采用prime5軟件設(shè)計PCR擴(kuò)增引物GSTM1：Forward 5'-GAA CTC CCT GAA AAG CTA AAG C-3'，Reverse 5'-GTT GGG CTC AAA TAT ACG GTG G-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長度219bp；GSTT1：Forward 5'-TTC CTT ACT GGT CCT CAC ATC TC-3'，Reverse 5'-TCA CCG GAT CAT GGC CAG CA-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長度480 bp；GSTP1：Forward 5'-ACC CCA GGG CTC TAT GGG AA-3'，Reverse 5'-TGA GGG CAC AAG AAG CCC CT-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物為177bp；β-actin為內(nèi)參照，引物序列為：Forward 5'-ACT CCC CAT CCC AAG ACC-3', Reverse 5'- CCT TAA TGT CAC GCA CGA T-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為400bp。引物由上海生物工程公司合成。

（二）外周血標(biāo)本采集和基因組DNA提取

采取所有研究對象外周靜脈血3mL并以乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）作為抗凝劑混勻為抗凝血液，放置于-80℃低溫冰箱備用。基因組DNA提取按照外周血微量基因組DNA提取試劑盒說明書操作，所提取DNA放置于-20℃冰箱備用。

（三）GSTs基因型PCR擴(kuò)增

采用Biomltra梯度PCR儀對所有DNA標(biāo)本進(jìn)行GSTM1、T1及P1基因型檢測。反應(yīng)體系為25μL（2 ×PCR Mixture 12.5μL，雙蒸水8.5μL，各引物量為0.5μL，濃度1. 0μmol/L，DNA模板2μL，濃度為100μg/μL）。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min；94℃變性30 s，60℃（63℃，58℃）退火30 s，72℃延伸30 s，共30個循環(huán)；72℃延伸7 min[6]。GSTP1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用BsmAI（ALW26I）限制性內(nèi)切酶進(jìn)行處理。

（四）電泳檢測

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測。GSTM1基因型檢測結(jié)果以能擴(kuò)增出219bp片斷為GSTM1（+），否則為GSTM1（-），GSTM1基因型檢測結(jié)果以能擴(kuò)增出480bp片斷為GSTT1（+），否則為GSTT1（-），并可見擴(kuò)增產(chǎn)物為400bp的β-actin，GSTP1基因野生型基因經(jīng)酶切后產(chǎn)物為177 bp，突變純合型基因經(jīng)酶切后產(chǎn)物為87 bp及90 bp，突變雜合型酶切后產(chǎn)物為177bp、87 bp及90 bp。所有樣本均重復(fù)3次PCR擴(kuò)增及電泳檢測。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

表1 谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GSTM1、T1、P1）基因遺傳多態(tài)性在正常對照組及病例組中頻率分布

結(jié) 果

一、GSTM1基因遺傳多態(tài)性與特發(fā)性男性不育癥相關(guān)性

研究發(fā)現(xiàn)GSTM1（-）和GSTM1（+）基因型頻率分布在正常對照組分別為41.88%和58.12%；而在特發(fā)性少弱精子癥不育患者組分別為60.57%和39.43%。病例組GSTM1（-）基因型分布明顯高于正常對照組（OR=2.132；95%CI=1.363-3.335；P=0.001），見表1和圖1。

二、GSTT1基因遺傳多態(tài)性與特發(fā)性男性不育癥相關(guān)性

研究發(fā)現(xiàn)GSTT1（-）和GSTT1（+）基因型頻率分布在正常對照組分別為47.86%和52.14%；而在特發(fā)性少弱精子癥不育患者組分別為62.60%和37.40%。病例組GSTT1（-）基因型分布明顯高于正常對照組（OR=1.832；95%CI=1.168-2.846；P=0.008），見表1和圖2。

三、GSTM1/T1基因遺傳多態(tài)性與特發(fā)性男性不育癥相關(guān)性

研究發(fā)現(xiàn)GSTM1/T1（+/+）、（+/-）、（-/+）及（-/-）基因型頻率分布在正常對照組為24.79%、33.33%、27.35%及14.53%；而在特發(fā)性少弱精子癥不育患者組分別為15.45%、23.98%、21.95%及38.62%；GSTM1/T1（-/-）基因型病例組的頻率分布明顯高于正常對照組（OR=3.701；95%CI=2.083-6.575；P＜0.0001），見表1和圖3。

圖1 GSTM1基因遺傳多態(tài)性水平凝膠電泳圖

圖2 GSTT1基因遺傳多態(tài)性水平凝膠電泳圖

圖3 GSTM1/T1基因遺傳多態(tài)性水平凝膠電泳圖

四、GSTP1基因遺傳多態(tài)性與特發(fā)性男性不育癥相關(guān)性

研究發(fā)現(xiàn)GSTP1（A/A）及GSTP1（A/G+G/G）基因型頻率分布在正常對照組分別為72.65%和27.35%；而在特發(fā)性少弱精子病不育患者組分別為67.89%和32.11%；谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶P1（A/G+G/ G）基因型頻率分布與正常對照組相比無明顯差異（OR=1.257；95%CI=0.772-2.0445；P=0.847），見表1和圖4。

圖4 GSTP1基因RFLP-PCR產(chǎn)物水平凝膠電泳圖

討 論

在過去20年間，多項研究均表明全世界人類精子數(shù)量和質(zhì)量均出現(xiàn)嚴(yán)重的下降趨勢，這將嚴(yán)重影響到男性人群未來的生育能力[7,8]。雖然導(dǎo)致男性精子質(zhì)量下降的確切原因到目前仍不清楚，但遺傳因素與環(huán)境因素的相互作用被認(rèn)為是導(dǎo)致精液質(zhì)量下降的最重要原因[9,10]。其中，遺傳因素被認(rèn)為是導(dǎo)致人類生精功能損傷的重要因素，然而到目前的研究仍未發(fā)現(xiàn)造成男性不育癥的明確遺傳因素[11]，在特發(fā)性少弱精子性男性不育癥患者中，約60%被研究發(fā)現(xiàn)與遺傳因素有關(guān)，且有多種基因遺傳多態(tài)性可能與睪丸精子生成功能受損存在密切關(guān)系[12]。

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）是一組具有解毒功能的蛋白超基因家族，屬于機(jī)體Ⅱ相解毒酶系統(tǒng)，其參與細(xì)胞對外源性化學(xué)物質(zhì)以及人工合成有機(jī)物質(zhì)解毒的各個生理階段，可分為胞漿型、胞膜型、線粒體型和白三烯C4合成酶[13]。其中水溶性GSTs目前又分為8個亞型，即：Alpha，Mu，Kappa，Omega，Pi，Sigma，Theta和Zeta。這些亞型分別由GSTA，GSTM，GSTK，GSTO，GSTP，GSTS，GSTT和GSTZ基因編碼[14,15]。Safarinejad等[16]對伊朗166例有生育史正常健康男性對照和166例特發(fā)性少弱畸形精子癥（OAT）患者的GSTs基因遺傳多態(tài)性分布研究后發(fā)現(xiàn)：GSTM1（-）或GSTT1（-）基因型可增加男性患不育癥的風(fēng)險；當(dāng)GSTP1基因野生型（AA）合并GSTM1（-）或GSTT1（-）基因型時均可增加患男性不育癥的風(fēng)險，當(dāng)GSTM1/T1（-/-）基因型并GSTP1（Ile/Ile）時，將極大增加患男性不育癥的風(fēng)險，然而GSTP1基因突變型（Val/Ile或Val/Val）卻降低患男性不育癥的風(fēng)險。Salehi等[17]對來源于伊朗北部的150例男性不育癥患者和200例健康對照男性GSTT1、GSTM1和CYP1A1*2A基因遺傳多態(tài)性進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GSTM1和GSTT1基因缺失型在特發(fā)性男性不育癥組中的頻率分別為61.0%和34.0%，而在正常健康對照中分別為33.0%和17.0%。GSTM1和T1基因均缺失型在男性不育癥組中明顯高于正常組。Aydos等[18]對110例男性不育癥患者和105例有生育史正常健康男性進(jìn)行病例-對照研究。發(fā)現(xiàn)GSTM1和CYP1A1*2C基因多態(tài)性分別與男性不育癥之間存在密切關(guān)系。當(dāng)一個患者為CYP1A1Val/Val（GG）或CYP1A1 Ile/Val（AG）基因型加GSTM1（-）時，其患男性不育癥的危險度是CYP1A1 Ile/Ile（AA）加GSTM1（+）患男性不育癥的6.90倍。通過既往多項研究我們發(fā)現(xiàn)機(jī)體谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶解毒酶基因多態(tài)性在男性不育癥致病因素中扮演著重要的角色，且不同的人群存在差異。

在該項研究中，我們發(fā)現(xiàn)GSTM1（-）分布頻率在特發(fā)性少弱精子癥不育患者組明顯高于正常對照組（OR=2.132，P=0.001）；GSTT1（-）分布頻率在特發(fā)性少弱精子癥不育患者組明顯高于正常對照組（OR=1.832，P=0.008）；同時，我們發(fā)現(xiàn)GSTM1/T1（-/-）基因型在病例組的頻率分布明顯高于正常對照組（OR=3.701，P＜0.0001），并發(fā)現(xiàn)GSTM1（-）及GSTT1（-）具有協(xié)同效應(yīng)。然而，GSTP1（A/G+G/G）基因型頻率分布在病例組及正常對照組相比無明顯差異（OR=1.257，P=0.847），表明GSTP1基因多態(tài)性與特發(fā)性少弱精子癥不育無明顯相關(guān)性。因此，該研究發(fā)現(xiàn)GSTM1、GSTT1基因缺失型可能是是特發(fā)性男性不育癥的危險因素，GSTP1基因突變型與特發(fā)性男性不育癥患者無明顯相關(guān)性。

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（2014-09-28收稿）

Correlative analysis of between glutathione S-transferase polymorphisms and idiopathic male infertility*

Tang Kaifa1, Xu Shaoyuan2, Zou Tiejun3, Ding Shangshu2,
Liu Ruizhe2, Wang Xinyang2, Tian Yuan1, Sun Fa1**, Xing Junping2**1. Department of Urology, the Aff liated Hospital of Guiyang Medical College; 2. Department of Urology,The First Aff liated
Hospital of Medical College of Xi 'an Jiaotong Universit y; 3. Department of Urology, Shaanxi People's Hospital

Xing Junping, E-mail: xingjpcn@gmail.com; Sun Fa, E-mail: sfguizhou@163.com

ObjectiveTo investigate the relationship between glutathione S- transferase enzyme gene GSTM1, T1 and P1 gene polymorphism and idiopathic male infertility.MethodsTotal of 246 patients with idiopathic male infertility and 117 healthy normal control were enrolled in the case-control study. Polymerase chain reaction (PCR) and polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) were used here to identify the genotype of GSTM1, GSTT1 and GSTP1.ResultsThe frequency of glutathione S- transferase M1 (-)genotype in the normal control group and idiopathic male infertility were 41.88% and 60.57%, with signif cant difference (P=0.001); and the frequency of glutathione S-transferase T1(-)genotype in the normal control group and idiopathic male infertility patients were 47.86% and 62.60%, withsignif cant difference (P=0.008); and the frequency of glutathione S- transferase M1/T1 (-/-) genotype in the normal control group and idiopathic male infertility patients were 14.53% and 38.62%, with significant difference (P<0.001); however the frequencies of glutathione S- transferase P1 gene mutation type in normal control group and idiopathic male infertility patients were 27.35% and 32.11%, with no signif cant difference (P=0.847). Conclution This study suggestd that GSTM1, GSTT1 gene deletion type may be the risk factors of idiopathic male infertility, but GSTP1 gene mutation types is not associated with idiopathic male infertility.

male infertility; glutathione S-transferase; polymorphism

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.11.001

R 698.2

資助: 國家自然科學(xué)基金（No. 81300541）; 貴州省度科學(xué)技術(shù)基金計劃項目（No. 黔科合J字[2013]2051號）
**共同通訊作者: 邢俊平, E-mail: xingjpcn@gmail.com; 孫發(fā), E-mail: sfguizhou@163.com