端粒酶hTERT反義核酸對(duì)TRAIL誘導(dǎo)的氟他胺耐受型前列腺癌LNCaP細(xì)胞凋亡作用的研究

高曉東陳一戎

1. 甘肅省中醫(yī)院血液凈化中心 （蘭州 730050）; 2. 甘肅省人民醫(yī)院

端粒酶hTERT反義核酸對(duì)TRAIL誘導(dǎo)的氟他胺耐受型前列腺癌LNCaP細(xì)胞凋亡作用的研究

高曉東1陳一戎2

1. 甘肅省中醫(yī)院血液凈化中心 （蘭州 730050）; 2. 甘肅省人民醫(yī)院

目的探討端粒酶（hTERT）基因的兩端部分硫代修飾反義核酸（AS PS-ODN）抑制氟他胺耐受型前列腺癌細(xì)胞LNCaP端粒酶活性后，腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）對(duì)LNCaP細(xì)胞凋亡的增敏作用。方法采用臺(tái)盼藍(lán)觀察hTERTAS PS-ODN與TRAIL共同作用對(duì)雄激素非依賴型前列腺癌細(xì)胞LNCaP生長(zhǎng)活力的影響；倒置顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞的形態(tài)變化；通過(guò)雙標(biāo)流式細(xì)胞儀測(cè)定凋亡細(xì)胞的百分率。結(jié)果hTERTAS PS-ODN作用于LNCaP細(xì)胞后加入TRAIL100ng/mL作用48h，LNCAP細(xì)胞的抑制率與對(duì)照組、正義核酸（S PS-ODN）組、AS PS-ODN組、TRAIL組及S PS-ODN+ TRAIL組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。hTERTAS PS-ODN作用于LNCAP細(xì)胞后加入TRAIL作用48h，細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)變化。hTERTAS PS-ODN作用于LNCaP細(xì)胞后加入100ng/mL TRAIL作用48h, 凋亡細(xì)胞的百分率分別與對(duì)照組、S PS-ODN組、AS PS-ODN組、TRAIL組及S PS-ODN+TRAIL組相比有顯著性差異（P＜0.05）。結(jié)論hTERT基因反義核酸對(duì)TRAIL誘導(dǎo)的氟他胺耐受型前列腺癌細(xì)胞LNCaP凋亡有增敏作用。

端粒, 末端轉(zhuǎn)移酶; 寡核苷酸類(lèi), 反義; 前列腺腫瘤; 細(xì)胞凋亡

前列腺癌是男性泌尿系最常發(fā)生的腫瘤,在美國(guó)其發(fā)病率在腫瘤患者中占第一位，死亡率占第二位[1]。我國(guó)尚無(wú)前列腺癌發(fā)病率、死亡率的精確統(tǒng)計(jì)資料，雖遠(yuǎn)不及歐美多，但隨著人們生活水平的提

高和人群普查的開(kāi)展，發(fā)病率逐年提高，而且初診時(shí)已有30%～50%的前列腺癌患者發(fā)生了轉(zhuǎn)移[2]。研究表明[3]，前列腺癌細(xì)胞屬于雄激素依賴性細(xì)胞，通過(guò)抑制人體睪丸細(xì)胞產(chǎn)生的90%的雄激素以及腎上腺組織產(chǎn)生的10%的雄激素，前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)速度變緩，出現(xiàn)惰性生長(zhǎng)的現(xiàn)象，甚至出現(xiàn)前列腺癌轉(zhuǎn)移灶萎縮的情況，治療效果良好。隨著抗雄藥物的治療，前列腺癌細(xì)胞會(huì)由雄激素依賴性轉(zhuǎn)化為雄激素非依賴型，抗雄藥物治療會(huì)逐漸失去作用。而對(duì)于雄激素非依賴型前列腺癌的治療，目前臨床上沒(méi)有一個(gè)行之有效的治療方法，是臨床上最棘手的問(wèn)題之一。研究表明[4]，人類(lèi)端粒酶主要在腫瘤組織中表達(dá)，而在正常組織及良性腫瘤中，除了一些具有高度再生潛力和生殖細(xì)胞組織外，幾乎不表達(dá)，表明端粒酶激活與腫瘤發(fā)生過(guò)程關(guān)系密切。現(xiàn)已證明端粒酶催化亞單位（hTERT）基因mRNA與端粒酶活性表達(dá)一致，其上游表達(dá)對(duì)端粒酶活性表達(dá)起重要作用，被認(rèn)為是端粒酶活性表達(dá)的限速因子[5]。近年來(lái)有研究表明，雄激素可以調(diào)節(jié)前列腺癌細(xì)胞的端粒酶活性。雄激素阻斷會(huì)導(dǎo)致前列腺癌細(xì)胞端粒酶限速因子hTERT基因的表達(dá)活性受到抑制伴有癌細(xì)胞端粒酶活性的降低[6]。但是端粒酶活性抑制劑只能降低腫瘤細(xì)胞端粒酶活性，并不影響其增殖。從腫瘤細(xì)胞端粒酶活性降低到其增殖受到抑制這一階段是端粒酶活性抑制劑應(yīng)用的主要障礙。因此，將端粒酶活性抑制劑和常規(guī)的放療、化療、免疫治療結(jié)合起來(lái)，將有效的提高對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用[7]。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡而不影響正常細(xì)胞，因而成為目前抗腫瘤研究的熱點(diǎn)[8]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究hTERT基因的兩端部分硫代修飾反義核酸（AS PS-ODN）對(duì)氟他胺耐受型前列腺癌細(xì)胞LNCaP端粒酶活性的影響，探討端粒酶活性抑制對(duì) TRAIL誘導(dǎo)氟他胺耐受型（雄激素非依賴型）前列腺癌細(xì)胞LNCaP凋亡的增敏作用，為氟他胺耐受型前列腺癌治療尋找新的途徑。

材料和方法

一、材料

（一）主要試劑

RPMI 1640培養(yǎng)粉為北京天為時(shí)代科技有限公司產(chǎn)品，胎小牛血清為蘭州民海生物制品公司產(chǎn)品，臺(tái)盼藍(lán)為蘭州百奧生物制品公司產(chǎn)品，TRAIL為武漢博士德生物制品公司產(chǎn)品。Annexin-V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒為北京天為時(shí)代科技有限公司產(chǎn)品。

（二）引物合成

根據(jù)hTERT基因mRNA的序列分析，設(shè)計(jì)出互補(bǔ)于起始密碼子的反義片段共20個(gè)堿基長(zhǎng)度作用的靶序列。hTERTAS PS-ODN的序列為5'-GGAGCGCGCG GCATCGCGGG-3'，S PS-ODN的序列為5'-CCCGCG ATGCCGCGCGCTCC-3'，每條鏈進(jìn)行兩端各3個(gè)堿基硫代修飾，由北京賽百勝生物制品公司合成，純化，分裝。

（三）細(xì)胞培養(yǎng)

LNCaP細(xì)胞株由本院泌尿研究所惠贈(zèng)。采用含10%胎小牛血清（60℃滅活3 min），100U/mL青霉素，100U/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液，在37℃，5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。LNCaP細(xì)胞含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液中氟他胺用無(wú)水乙醇溶解后加入磷酸鹽緩沖液（PBS，常規(guī)培養(yǎng)于pH7.2）至氟他胺終濃度為10-4mol/L儲(chǔ)存。LNCaP加入氟他胺至終濃度為10-7mol/L后連續(xù)培養(yǎng)80代，使之成為氟他胺耐受前列腺癌細(xì)胞LNCaP-f u，實(shí)驗(yàn)選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

二、方法

（一）臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)細(xì)胞活力

實(shí)驗(yàn)分為6組：AS PS-ODN組、正義核酸（S PSODN組）、空白對(duì)照組、TRAIL組、TRAIL+ S PSODN組、TRAIL+ AS PS-ODN組。采用24孔培養(yǎng)板，每組接種3孔，每孔接種1×105細(xì)胞。第一天加入ODN 10μmol/L，24h后加入100ng/mL TRAIL，空白對(duì)照組加入等量培養(yǎng)液。加入TRAIL后24、48、72、96h采用臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)LNCaP細(xì)胞的活力。

（二）細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察

置不同作用時(shí)間后的細(xì)胞于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。

（三）流式細(xì)胞儀測(cè)定凋亡細(xì)胞的百分率

調(diào)整細(xì)胞待測(cè)密度為1×105個(gè)/mL，取1mL細(xì)胞，冷PBS洗2次（3.38×103g4℃ 離心10 min），細(xì)胞懸浮于200μl結(jié)合緩沖液中。加入10μl Annexin-VFITC 和5μl的PI，避光室溫反應(yīng)15 min。加入300 μl結(jié)合緩沖液，立即上機(jī)檢測(cè)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)hTERTAS PS-ODN與TRAIL聯(lián)合作用對(duì)LNCaP細(xì)胞活力的影響

hTERTAS PS-ODN作用于LNCaP細(xì)胞24h后加入TRAIL100ng/mL共同作用48h，LNCaP細(xì)胞抑制率與AS PS-ODN組，S PS-ODN組，空白對(duì)照組，TRAIL組，TRAIL+ S PS-ODN組相比，有顯著性差異（P＜0.01）（見(jiàn)圖1）。

圖1hTERT反義核酸與100ng/mL TRAIL聯(lián)合作用48h對(duì)LNCaP細(xì)胞活力的影響

二、細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)觀察

hTERTAS PS-ODN作用于LNCaP細(xì)胞24h后加入100ng/mL TRAIL共同作用48h，見(jiàn)凋亡細(xì)胞明顯增多，呈現(xiàn)為細(xì)胞縮小、染色質(zhì)凝集、核固縮并斷裂形成數(shù)個(gè)大小不等的圓形顆粒，并釋放到細(xì)胞外形成凋亡小體（見(jiàn)圖2）。

三、流式細(xì)胞儀測(cè)定凋亡細(xì)胞的百分率

hTERTAS PS-ODN與100ng/mL TRAIL聯(lián)合作用48h，T24細(xì)胞凋亡百分率為36.1%，hTERTS PSODN與100ng/mL TRAIL聯(lián)合作用48h，T24細(xì)胞凋亡百分率為11.2%，100ng/mL TRAIL單獨(dú)作用48h，T24細(xì)胞凋亡百分率為8.25%，hTERTAS PS-ODN作用組T24細(xì)胞凋亡百分率為2.18%，hTERTS PS-ODN作用組T24細(xì)胞凋亡百分率為2.0%，對(duì)照組T24細(xì)胞凋亡百分率為2.0%，hTERTAS PS-ODN與TRAIL聯(lián)合作用48h，T24細(xì)胞凋亡百分率與單用TRAIL作用組，hTERTS PS-ODN與TRAIL聯(lián)合作用組，hTERTAS PS-ODN，hTERTS PS-ODN作用組及對(duì)照組進(jìn)行比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。單用TRAIL作用組與hTERTS PS-ODN與TRAIL聯(lián)合作用組比較兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖3。

討 論

文獻(xiàn)報(bào)道[9]，端粒酶hTERT在各種癌細(xì)胞株及腫瘤組織中，表現(xiàn)出高水平的表達(dá)，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。近年來(lái)有研究表明，雄激素可以調(diào)節(jié)前列腺癌細(xì)胞的端粒酶活性，雄激素阻斷會(huì)導(dǎo)致前列腺癌細(xì)胞端粒酶限速因子hTERT基因的表達(dá)活性受到抑制伴有癌細(xì)胞端粒酶活性的降低[6]。為雄激素非依賴型前列腺癌治療提供了新的治療方法。

反義技術(shù)的基本原理就是根據(jù)堿基互補(bǔ)原則，用人工合成或生物體表達(dá)的特定互補(bǔ)的DNA或RNA片段（反義核酸）以抑制或封閉專(zhuān)一靶基因表達(dá)的技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)采用兩端部分硫代修飾反義核酸。硫代是指硫元素代替硫酸基團(tuán)自由氧，是目前反義核酸應(yīng)用研究最多的一種修飾，可以增強(qiáng)反義核酸的穩(wěn)定性，提高反義核酸對(duì)核酸酶的耐受性，使其藥物半衰期增加10倍，同時(shí)增強(qiáng)反義核酸對(duì)腫瘤細(xì)胞的親核性，從而使反義核酸更容易進(jìn)入腫瘤細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮其抗腫瘤作用。

圖2hTERTAS PS-ODN作用于LNCaP細(xì)胞24h加入TRAIL共同作用48h，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)

圖3hTERT反義核酸與TRAIL100ng/mL聯(lián)合作用48h，LNCaP細(xì)胞凋亡百分率

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LNCaP細(xì)胞經(jīng)過(guò)hTERTAS PS-ODN與TRAIL聯(lián)合作用，細(xì)胞活力明顯受到抑制，出現(xiàn)了細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變，呈現(xiàn)為細(xì)胞縮小，染色質(zhì)凝集，核固縮并出現(xiàn)凋亡小體，同時(shí)，LNCaP細(xì)胞凋亡百分率明顯增高。這與文獻(xiàn)報(bào)道的有關(guān)反義核酸作用的研究一致[10]。

有研究表明，TRAIL是腫瘤壞死因子（TNF）細(xì)胞因子家族的新成員，和TNF、凋亡相關(guān)因子配體（FasL）一樣，TRAIL也是通過(guò)與細(xì)胞膜上的相應(yīng)的死亡受體（DR4, DR5）結(jié)合，激活Caspase通路，傳遞和放大凋亡信號(hào)，從而誘導(dǎo)靶細(xì)胞發(fā)生快速、大量、高效的凋亡反應(yīng)[11]。TRAIL與其受體DR4,DR5特異性結(jié)合激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，啟動(dòng)凋亡程序的進(jìn)行[12]。DR4,DR5同樣是一種促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因，可以合成執(zhí)行細(xì)胞凋亡的酶：核酸內(nèi)切酶（DNase）和凋亡蛋白酶（caspase）。前者導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞染色體DNA 片段化，后者水解細(xì)胞的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞的全面解體[13]。抑制hTERT表達(dá)后，腫瘤細(xì)胞失去了DNA修復(fù)能力，使染色體片段化，同時(shí)削弱了腫瘤細(xì)胞對(duì)DNA損傷的反應(yīng)[14]，因而加速了TRAIL對(duì)腫瘤細(xì)胞的凋亡作用。

總之，hTERT AS PS-ODN抑制了端粒酶hTERT表達(dá)可以增加LNCaP細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡的敏感性。采用端粒酶活性抑制劑結(jié)合腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體治療氟他胺耐受型前列腺癌具有良好應(yīng)用前景。

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（2014-01-10收稿）

Effects of telomerase inhibition with hTERT antisense on TRAIL-induced apoptosis in flutamide insensitive prostate cancer cells (LNCaP)

Gao Xiaodong1, Chen Yirong2
1. The Traditional Chinese Medicine Hospital of Gansu Province, Lanzhou 730050, China;
2. The People Hospital of Gansu Province

ObjectiveTo investigated the effects of telomerase inhibition withhTERTantisense on TRAIL-induced apoptosis in flutamide insensitive prostate cancer cells (LNCaP).MethodsAntisense phosphorothioate oligodeoxynucleotide (AS PS-ODN) was synthesized and purified. Cell viability was determined by MTT assay.Cell apoptosis was observed by morphological method and measured by f owcytometry.ResultsAS PS-ODN could signif cantly increase TRAIL-induced apoptosis in LNCaP cells.ConclusionInhibition of telomerase withhTERTantisense can enhance TRAIL-induced apoptosis in f utamide insensitive prostate cancer cells (LNCaP).

telomerase; oligonucleotides, antisense; prostatic neoplasms; apoptosis

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.05.005

R 737.25