輔助生殖技術(shù)中Zn2+抑制精子DNA碎片形成*

吳金香王正堯謝遠志蔡俊峰

1. 福建醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院檢驗科（泉州 362000）; 2. 福建醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院生殖男科

輔助生殖技術(shù)中Zn2+抑制精子DNA碎片形成*

吳金香1**王正堯1謝遠志2蔡俊峰1

1. 福建醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院檢驗科（泉州 362000）; 2. 福建醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院生殖男科

輔助生育技術(shù)（assisted reproductive technology，ART）已成為治療不孕癥患者的主要治療方法之一，因此保證輔助生殖成功以實現(xiàn)優(yōu)生優(yōu)育是非常重要的。ART中精子體外優(yōu)選處理、冷凍及復蘇過程中導致的精子氧化損傷影響著精液常規(guī)的各項指標[1]。Zn2+是男性體內(nèi)精子生長發(fā)育過程中不可缺少的微量元素。大量研究表明[2-4]，體內(nèi)Zn2+具有抗氧化作用，然而ART中Zn2+能否保護精子受氧化刺激的損傷作用，目前尚無研究，本研究在優(yōu)選后的精子中加入適量的Zn2+，通過比較精子的存活率、活力以及精子DNA碎片檢測判斷Zn2+能否抑制H2O2的氧化損傷精子DNA作用，旨在判斷ART中Zn2+能否抑制精子DNA碎片的形成。

材料和方法

一、材料

10例正常健康男性精液樣品，取自本院有生育能力的青年自愿者，年齡25～30（26±2）歲。ZnCL2為瑞士Adamas-beta公司產(chǎn)品。30% H2O2由西隴化工股份有限公司提供。40%上層梯度離心液，80%下層梯度離心液,洗精液均為美國Quinn's公司產(chǎn)品。精子DNA碎片檢測試劑盒購于深圳博銳德生物科技有限公司。精子質(zhì)量分析系統(tǒng)為北京國聯(lián)醫(yī)療技術(shù)有限公司產(chǎn)品。 OLYMPUS.CX31型光學顯微鏡為日本OLYMPUS公司生產(chǎn)。

二、方法

本研究設(shè)計不同濃度梯度的H2O2（0.1%，0.01%和0.001%）和Zncl2（50 nmol/L，25 nmol/L，12.5 nmol/L，6.2 nmol/L），應(yīng)用國聯(lián)精子檢測系統(tǒng)檢測精子的存活率和活力來選擇最佳的干預濃度為0.001% H2O2和12.5 nmol/L Zncl2。10份正常精液標本，置37℃水浴箱待液化，分別用40%和80%高密度離心液制備梯度液，300×g，15min獲取優(yōu)質(zhì)精子，Quinn’s洗精液300×g，5min洗滌優(yōu)質(zhì)精子2次后將精子密度至5～10×109/L，每份0.3mL平均分為3組：實驗組（Zncl2+H2O2）組含12.5 nmol/L Zncl2及0.001%的H2O2；H2O2組含0.001% H2O2；空白組加入等體積0.9%NaCl2。3組同時置37℃、5%CO2孵箱中孵育5h和24h后分析不同實驗組之間的差異。

1. 精子活力與存活率的分析：3組同時置37℃，5% CO2孵箱中孵育5h和24h后，用國聯(lián)精子檢測系統(tǒng)觀察精子運動功能的變化，從而判斷精子的存活率與活力。

2. 精子DNA碎片的檢測：本實驗采用精子染色質(zhì)擴散法進行檢測：3組實驗分別取60μl參照精子DNA檢測試劑盒說明書進行操作。DNA完整的精子在經(jīng)過變性和去掉核蛋白后DNA擴散形成特征性的光暈，而存在DNA碎片的精子不會產(chǎn)生這種特征性的光暈。根據(jù)光暈的有無和大小判斷精子DNA的完整程度。精子DNA碎片判斷標準：精子頭部僅產(chǎn)生較小的光暈或無光暈，單側(cè)光暈的厚度不超過精子頭部最小直徑的1/3，（如圖1）。隨機選取視野觀察（×400倍），計數(shù)500個精子，按以下公式計算出存在DNA碎片精子百分率：

圖1 精子DNA碎片檢測示意圖

3. 應(yīng)用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析，多組的均數(shù)比較采用隨機區(qū)組設(shè)計的方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，雙側(cè)檢驗，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、Zn2+對受H2O2影響精子活力與存活率的保護作用

10例正常健康男性精液經(jīng)ART中精液優(yōu)化處理后在H2O2作用下精子運動能力顯著下降，明顯低于同時加入適量Zncl2的實驗組，差異比較均具統(tǒng)計學意義（P＜0.001），見表1。

表1 Zn2+對H2O2影響優(yōu)選后精子活力和存活率的保護作用（n=10，±s，%）

表1 Zn2+對H2O2影響優(yōu)選后精子活力和存活率的保護作用（n=10，±s，%）

5h后 24h后活力 存活率 活力 存活率空白組 84.25 94.2 78.61 92.14 H2O2組 3.43 23.24 0 0實驗組 26.14 61.32 0.79 6.35

二、Zn2+對H2O2影響精子損傷DNA的抑制作用

10例正常健康男性精液經(jīng)ART中精液優(yōu)化處理后在H2O2刺激下精子DNA完整性嚴重破壞，DNA損傷程度明顯高于同時加入適量Zncl2的實驗組，差異比較均具統(tǒng)計學意義（P＜0.001），結(jié)果見圖2。

圖2 3組精子DNA損傷程度比較

討 論

男性不育占不育癥30%，常見的病因有生殖系炎癥、精索靜脈曲張、無精子癥、畸形精子等。精子DNA碎片化是近幾年的研究熱點，其形成是導致男性不孕的主要原因之一，是精子DNA損傷的一種表現(xiàn)，與精子細胞凋亡密切相關(guān)[5,6]。男性精子DNA碎片化的形成造成精子內(nèi)部遺傳信息的不完整，嚴重影響生育情況，會導致不孕、反復流產(chǎn)和胎兒畸形，造成胎兒發(fā)育停滯和輔助生殖失敗等[7,8]。因此如何避免精子DNA碎片化的形成是目前的研究熱點。目前國內(nèi)外大量的研究表明：精子DNA碎片化形成可能與炎癥、凋亡、氧化損傷以及環(huán)境因素等多種因素作用相關(guān)[5-8]。

ART已成為不孕癥患者的主要治療方法之一，因此保證輔助生殖成功以實現(xiàn)優(yōu)生優(yōu)育是非常重要的。ART已經(jīng)發(fā)展30多年，盡管ART可以促進精液液化，通過各種方法去除精液中的白細胞、死精子以及部分畸形精子等，從而達到精子優(yōu)選的目的，但仍無法去除DNA碎片化的精子，且ART中存在造成精子DNA碎片化的可能因素，比如精子優(yōu)選方法選擇、精子優(yōu)選過程中離心力和離心時間的選擇、優(yōu)選后精子的培養(yǎng)時間以及精子的冷凍與復蘇等[9,10]，因此降低精子優(yōu)選過程中精子DNA碎片，提高體外輔助受孕率和優(yōu)生優(yōu)育率是非常必要的，但目前尚無這方面的研究。

目前國內(nèi)外多數(shù)研究停滯于精子DNA碎片化的檢測方法學以及臨床意義的研究，其形成的確切機制以及預防措施方面的研究不多。Villani等[6]研究者認為精子DNA碎片化形成是導致精子凋亡的前期表現(xiàn)，而細胞凋亡與DNase和caspases密切相關(guān)?；钚匝酰╮eactive oxygen species，ROS）是細胞正常代謝產(chǎn)生的有毒物質(zhì)，ROS增加影響精子質(zhì)量以及精子DNA完整性，從而導致不孕、反復流產(chǎn)和胎兒畸形等。ROS及炎癥刺激等激活精子細胞內(nèi)DNase和caspases系統(tǒng)，從而降解精子DNA導致精子DNA損傷引起精子凋亡，因此研究者認為精子DNA碎片化形成與DNase的活化以及caspases系統(tǒng)的激活相關(guān)[6,11]。Sibirtsev等[11]應(yīng)用H2O2和DNase對人、老鼠和公牛3個物種的精子進行處理研究，結(jié)果表明3個物種精子DNA碎片損傷與過氧化氫和DNase酶密切相關(guān)，而人的精子對DNase酶的敏感性最高。Sibirtsev等[11]研究Ca2+，Mg2+依賴的DNase在中間球海膽（Sea Urchin Strongylocentrotus intermedius）精子中的活化并激活caspases系統(tǒng)降解精子DNA的機制，并指出Zn2+可以阻斷DNase的降解中間球海膽精子DNA的作用，從而減少中間球海膽精子DNA碎片的作用。

Zn2+在睪丸生精過程中具重要的作用，是男性體內(nèi)精子生長發(fā)育過程中不可缺少的微量元素。目前尚無學者研究Zn2+是否在體外ART中的預防和減少精子DNA碎片形成的作用。本研究采用ART中優(yōu)選的精子為實驗對象，以H2O2為氧化刺激物，通過精子DNA碎片的檢測結(jié)合國聯(lián)軟件系統(tǒng)分析并比較精子的活率、活力，判斷Zn2+能否抑制H2O2對精子的氧化損傷作用。實驗結(jié)果表明，在ART中H2O2可明顯損傷精子DNA的作用，適量的Zn2+能明顯減少H2O2對人類精子的DNA碎片，從而保護精子DNA的完整性，為ART以及優(yōu)生優(yōu)育提供實驗依據(jù)。另外在本研究中發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)基中Zn2+濃度遠低于精漿中的Zn2+濃度，主要是Zn2+在體內(nèi)不同部位的濃度分布不一，ART中應(yīng)用的培養(yǎng)基主要是參照輸卵管液，可見在輸卵管位置Zn2+的量明顯少于精漿。

精子; DNA碎片裂; 生殖技術(shù), 輔助

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6 Villani P, Eleuteri P, Grollino MG,et a1. Sperm DNA fragmentation induced by DNAse I and hydrogen peroxide: an in vitro comparative study among different mammalian species.Reproduction2010; 140(3): 445-452

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11 Sibirtsev JT, Shastina VV, Menzorova NI,et a1. Sperm DNA fragmentation induced by DNAse I and hydrogen peroxide: an in vitro comparative study among different mammalian species.Mar Biotechnol(NY)2011; 13(3): 536-543

（2014-04-05收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.08.012

R 698.2

資助: 福建省衛(wèi)生廳青年科研基金資助項目（NO.2011-1-36）**

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