前列腺炎Ⅰ號(hào)對(duì)CNP大鼠前列腺組織TGF-β1、CTGF表達(dá)的影響*

朱 勇孫 磊吳云皓楊 凱焦剛亮牛培寧曾慶琪**

1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)（南京 210046）;

2. 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬鹽城市中醫(yī)院男科; 3. 江蘇建康職業(yè)學(xué)院

前列腺炎Ⅰ號(hào)對(duì)CNP大鼠前列腺組織TGF-β1、CTGF表達(dá)的影響*

朱 勇1,2孫 磊3吳云皓1楊 凱1焦剛亮1牛培寧1曾慶琪3**

1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)（南京 210046）;

2. 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬鹽城市中醫(yī)院男科; 3. 江蘇建康職業(yè)學(xué)院

目的探討前列腺炎Ⅰ號(hào)治療慢性非細(xì)菌性前列腺炎的作用機(jī)制。方法將70只雄性大鼠隨機(jī)分為空白組（生理鹽水10ml?kg-1）、模型組（生理鹽水10ml?kg-1）、陽(yáng)性組（前列舒樂(lè)顆粒2.4g?kg-1）和前列腺炎Ⅰ號(hào)小劑量組（10g?kg-1）、前列腺炎Ⅰ號(hào)中劑量組（20g?kg-1）、前列腺炎Ⅰ號(hào)大劑量組（40g?kg-1）。采用免疫性造模方法，空白組則注射生理鹽水，30d后重復(fù)造模一次，45d后灌胃給藥。給藥28d后，剝?nèi)∏傲邢俳M織，免疫組化檢測(cè)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（ CTGF）表達(dá)水平。結(jié)果與空白組相比，其余各組大鼠前列腺組織TGF-β1和CTGF表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組相比，其余各組大鼠前列腺組織TGF-β1、CTGF表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與陽(yáng)性組相比，其余各組大鼠前列腺組織TGF-β1、CTGF表達(dá)水平均有明顯差異性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 前列腺炎Ⅰ號(hào)各劑量組能有效抑制CNP大鼠前列腺組織TGF-β1和CTGF的表達(dá)水平，改善前列腺組織的纖維化程度，其中，中、大劑量組效果更佳。

前列腺炎/藥物療法; 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1

前列腺炎Ⅰ號(hào)為曾慶琪教授臨床經(jīng)驗(yàn)方，對(duì)慢性前列腺炎尤其是非細(xì)菌性前列腺炎（CNP，Chronic Nonbacterial Prostatitis）的治療療效顯著[1,2]。通過(guò)構(gòu)建非細(xì)菌性前列腺炎模型，評(píng)判前列腺炎Ⅰ號(hào)對(duì)CNP大鼠前列腺組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）表達(dá)的影響，探討其作用機(jī)制，為新藥開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)參考。

材料與方法

一、材料

（一）動(dòng)物

SD雄性大鼠80只，體質(zhì)量180-220g，由江蘇大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)SCXK(蘇)2009-0002。

（二）藥品

前列腺炎Ⅰ號(hào)（萆薢、石菖蒲、臺(tái)烏藥、益智仁、威靈仙、冬瓜子、白芷、馬鞭草、茯苓、皂角刺、菟絲子、五味子、水蛭等）由江蘇省中醫(yī)院制劑部提供；前列舒樂(lè)顆粒（主要成分為淫羊藿、黃芪、車前草、蒲黃、川牛膝，4g/袋），貴州關(guān)德興寶芝林藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào)為國(guó)藥準(zhǔn)字Z52020270，產(chǎn)品批號(hào)為20130404；弗氏完全佐劑（FCA），由MPBIO（FRANCE）生產(chǎn)，批號(hào)：06858；吸附無(wú)細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗，長(zhǎng)春長(zhǎng)生生物科技股份有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào)為國(guó)藥準(zhǔn)字S20083110，批號(hào)為20120302。

（三）試劑

考馬斯亮藍(lán)試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號(hào)為20130315；TGF-β1兔多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司），批號(hào)為20130426；CTGF兔多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司），批號(hào)為20130507；即用型SABC-POD（兔IgG）試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），批號(hào)為20130621；DAB顯色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），批號(hào)為20130208。

（四）儀器

FA1104電子分析天平（上海舜宇平恒科學(xué)儀器有限公司）；Synergy HT酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek公司）；GS-15R 低溫離心機(jī)（美國(guó)BECKMAN公司）；TD6001電子天平，天津市天馬儀器廠；-80℃超低溫冰箱（日本SANYO公司）；LDZ5-2離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；ULTRA-TURRAX勻漿機(jī)（德國(guó)IKA公司）。

二、方法

（一）分組

將70只SD雄性大鼠隨機(jī)分為6組，其中空白組10只，模型組12只，陽(yáng)性組12只，前列腺炎Ⅰ號(hào)小劑量組12只，前列腺炎Ⅰ號(hào)中劑量組12只，前列腺炎Ⅰ號(hào)大劑量組12只。

（二）造模

1. 大鼠前列腺蛋白提純液制備方法：參考文獻(xiàn)[3]，將10只SD雄性大鼠脫頸椎處死，無(wú)菌條件下剝?nèi)∏傲邢俳M織，生理鹽水沖洗，加入含0.5%TritonX-100的生理鹽水，冰浴勻漿，將勻漿液放于4℃高速低溫離心機(jī)中10000r/min，離心5min，吸取上清液，比濁法測(cè)定其蛋白濃度。臨用前，用0.01mmol/L PBS調(diào)節(jié)至15mg/mL。

2. 造模方法：參考文獻(xiàn)[4]，大鼠乙醚麻醉，模型組、陽(yáng)性組、前列腺Ⅰ號(hào)小中大各劑量組均腹腔注射百白破疫苗0.5mL，皮下多點(diǎn)注射前列腺蛋白提純稀釋液（15mg/mL）與FCA混合乳劑（1:1體積）1mL，注射點(diǎn)為雙側(cè)腹股溝各0.2mL，雙側(cè)大腿內(nèi)側(cè)各0.1mL，背部0.4mL，空白組用同樣方法注射等量生理鹽水。30d后，重復(fù)一次，第45天每組各處死2只動(dòng)物，剝?nèi)∏傲邢俳M織送病理檢查，觀察前列腺組織結(jié)構(gòu)符合慢性炎癥改變可判定造模成功（前期預(yù)實(shí)驗(yàn)研究顯示該造模方法的成功率為100%）。

（三）給藥方法

各組均按體質(zhì)量灌胃給藥，根據(jù)人-大鼠體表面積換算系數(shù)換算，每天陽(yáng)性組給予前列舒樂(lè)顆粒2.4g/ kg（相當(dāng)于成人臨床用量4倍），前列腺Ⅰ號(hào)小劑量組給予生藥量10g/kg（相當(dāng)于成人臨床用量2倍），前列腺Ⅰ號(hào)中劑量組給予生藥量20g/kg（相當(dāng)于成人臨床用量4倍），前列腺Ⅰ號(hào)大劑量組給予生藥量40g/kg（相當(dāng)于成人臨床用量8倍），空白組、模型組給予等量生理鹽水。造模45d后開(kāi)始給藥，共28d，末次給藥4h后處死所有動(dòng)物。給藥過(guò)程中，前列腺炎Ⅰ號(hào)中、大劑量組各死亡1只。

（四）觀察指標(biāo)及結(jié)果分析

剝?nèi)〈笫笄傲邢俳M織，免疫組化檢測(cè)TGF-β1 、CTGF表達(dá)水平。免疫組化結(jié)果用多功能彩色病理圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行處理，由東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬中大醫(yī)院臨床病理科協(xié)助分析。應(yīng)用MataMorph圖像分析軟件，每張病理切片在40×10高倍鏡視野下隨機(jī)選取5個(gè)視野，測(cè)量前列腺組織陽(yáng)性表達(dá)區(qū)平均積分的光密度值以及面密度值，取其平均值作為所檢測(cè)指標(biāo)的表達(dá)值。

（五）統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，呈正態(tài)分布的連續(xù)型變量以（±s）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)描述，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組間均數(shù)比較采用LSD檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、光鏡下觀察

免疫組織化學(xué)染色顯示，陽(yáng)性表達(dá)為胞漿中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒。其中，TGF-β1主要分布于前列腺組織的上皮及炎癥浸潤(rùn)細(xì)胞的胞漿內(nèi)，而CTGF則主要分布于前列腺組織的間質(zhì)細(xì)胞及炎癥浸潤(rùn)細(xì)胞的胞漿內(nèi)。

二、前列腺炎Ⅰ號(hào)對(duì)CNP大鼠前列腺組織TGF-β1表達(dá)的影響

免疫組織化學(xué)分析顯示，空白組大鼠前列腺組織TGF-β1呈陰性表達(dá)，與各組有顯著差異（P＜0.01或P＜0.05）；模型組呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，與各組有顯著差異（P＜0.01）；與陽(yáng)性組相比，各組均有差異性（P＜0.01或P＜0.05）。結(jié)果顯示前列腺炎Ⅰ號(hào)各劑量組均能抑制TGF-β1的表達(dá)，其中，中、大劑量組效果更佳，見(jiàn)圖1、表1。

圖1 各組大鼠前列腺組織TGF-β1染色（免疫組織化學(xué) ×200）

表1 大鼠前列腺組織免疫組化（TGF-β1）染色結(jié)果分析

三、前列腺炎Ⅰ號(hào)對(duì)CNP大鼠前列腺組織CTGF表達(dá)的影響

免疫組織化學(xué)分析顯示，空白組大鼠前列腺組織CTGF呈陰性表達(dá)，與各組有顯著差異（P＜0.01）；模型組呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，與各組有顯著差異（P＜0.01）；與陽(yáng)性組相比，各組均有差異性（P＜0.01或P＜0.05）。結(jié)果顯示前列腺炎Ⅰ號(hào)各劑量組均能抑制CTGF的表達(dá)，其中，中、大劑量組效果更佳，見(jiàn)圖2、表2。

圖2 各組大鼠前列腺組織CTGF染色（免疫組織化學(xué) ×200）

表2 大鼠前列腺組織免疫組化（CTGF）染色結(jié)果分析

討 論

慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛綜合征是男科較為常見(jiàn)的疾病之一，其病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，臨床治療效果不佳，中醫(yī)辨證治療有一定的特色和優(yōu)勢(shì)[5]。據(jù)有關(guān)學(xué)者研究顯示，CP患者后期前列腺質(zhì)地變硬，病理檢查可見(jiàn)不同程度的纖維化，給臨床治療帶來(lái)一定的困難[6]。

TGF-β1為一種強(qiáng)效致纖維化因子，具有調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、刺激細(xì)胞外基質(zhì)分泌與沉積的功能，在組織器官纖維化過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[7]。CTGF可與不同受體結(jié)合而發(fā)揮其生物效應(yīng)，廣泛參與機(jī)體組織的纖維化、創(chuàng)傷修復(fù)、疤痕增生、軟骨形成和胚胎發(fā)育等生理病理過(guò)程[8]。有關(guān)學(xué)者前期研究表明，TGF-β1、CTGF可能參與了CNP及其纖維化發(fā)病過(guò)程[9]，因此，通過(guò)檢測(cè)前列腺組織中TGF-β1、CTGF的表達(dá)水平，對(duì)前列腺炎治療效果的評(píng)價(jià)具有較高的參考價(jià)值。

前列腺炎Ⅰ號(hào)由萆薢、石菖蒲、臺(tái)烏藥、益智仁、威靈仙、冬瓜子、白芷、馬鞭草、茯苓、皂角刺、菟絲子、五味子、水蛭等組成，其中臺(tái)烏藥、益智仁、菟絲子益腎補(bǔ)虛，萆薢、威靈仙、冬瓜子、白芷、馬鞭草清熱利濕，皂角刺、水蛭活血通絡(luò)止痛，諸藥合用共奏益腎清利活血之功?，F(xiàn)代臨床研究證實(shí)，該方具有改善局部微循環(huán)、抗炎鎮(zhèn)痛、緩解平滑肌痙攣并調(diào)節(jié)局部組織免疫功能的功效[1,2]。前期實(shí)驗(yàn)研究表明，前列腺炎Ⅰ號(hào)對(duì)CNP大鼠血清細(xì)胞因子IL-2、IL-6的表達(dá)具有顯著的抑制作用[10]。

本次實(shí)驗(yàn)采用自身免疫性造模方法，其模型持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)、穩(wěn)定可靠，具有較好的病理特異性，與人CNP病變機(jī)理較為相似，國(guó)際公認(rèn)度高[11]。研究顯示，前列腺組織中TGF-β1、CTGF的表達(dá)與慢性前列腺炎的病變程度具有相關(guān)性；前列腺炎Ⅰ號(hào)各劑量組對(duì)CNP大鼠前列腺組織中TGF-β1、CTGF的表達(dá)具有顯著的抑制作用，其中中、大劑量組療效更佳。表明前列腺炎Ⅰ號(hào)能有效抑制CNP大鼠前列腺組織的纖維化，改善前列腺炎的病變程度，對(duì)慢性非細(xì)菌性前列腺炎尤其是病程較長(zhǎng)的患者具有較高的推廣應(yīng)用價(jià)值。

1 曾慶琪, 吉慶, 譚廣興, 等. 前列腺炎Ⅰ號(hào)顆粒治療慢性盆腔疼痛綜合征的臨床研究. 長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)2012; 28(2): 211-212

2 朱勇, 楊凱, 曾慶琪. 曾慶琪教授經(jīng)驗(yàn)方前列腺炎Ⅰ號(hào).中國(guó)性科學(xué) 2013; 22(10): 81-83

3 周青, 何清湖, 田雪飛, 等. 麝香配伍乳香促虎杖提取物治療慢性非細(xì)菌性前列腺炎的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究. 中華男科學(xué)雜志 2012; 18(5): 460-465

4 宋國(guó)宏, 李文玉, 張晨, 等. 免疫法制作大鼠非細(xì)菌性前列腺炎模型的量效關(guān)系研究. 中華男科學(xué)雜志 2011; 17(7): 586-590

5 朱勇, 劉正建, 曾慶琪. 慢性盆腔疼痛綜合征的中醫(yī)治療現(xiàn)狀. 中國(guó)男科學(xué)雜志 2013; 27(2): 63-66, 69

6 Niekel JC. Recommendations for the evaluation of patients with prostatitis.World J Urol2003; 21(2): 75-81

7 Gressner AM, Weiskirchen R, Breitkopf K, et al. Roles of TGF-beta in hepatic fibrosis.Front Biosci2002; 7: d793-d807

8 Oemar BS, Luscher TF. Connective tissue growth factor, Friend or foe?Arterioscler Thromb Vasc Biol1997; 17(8): 1483-1489

9 譚丹, 張唯力, 張建華, 等. 慢性非細(xì)菌性前列腺炎大鼠前列腺組織中TGF-β1、CTGF 的表達(dá)及意義. 中國(guó)男科學(xué)雜志 2008; 22(5): 22-25, 34

10 曾慶琪, 朱勇, 孫磊, 等. 前列腺炎Ⅰ號(hào)對(duì)CNP大鼠血清IL-2、IL-6含量的影響. 世界中西醫(yī)結(jié)合雜志 2013; 8(10): 1058-1060, 1062

11 韓蕾, 周曉輝. 慢性非細(xì)菌性前列腺炎動(dòng)物模型的研究進(jìn)展.中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào) 2008; 16(2): 157-159

（2014-05-20收稿）

Effect of No.I decotion for prostatitis on the expressions of TGF-β1 and CTGF in prostatic tissue of rat models with chronic nonbacterial prostatitis

Zhu Yong1,2, Sun Lei3, Wu Yunhao1,Yang Kai1, Jiao Gangliang1, Niu Peining1, Zeng Qingqi3**
1. Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210046, China;
2. TCM Hospital of Yancheng City Aff liated to Nanjing University of Chinese Medicine; 3. Jiangsu Jiankang Vocational College

Zeng Qingqi, E-mail: zengqq111@126.com

ObjectiveTo study the mechanism of No.I decotion in the treatment of CNP rats with chronic prostatitis.MethodsTotal of 70 rats were divided into 6 groups including normal contrast group (treated with normal saline 10ml?kg-1), model contrast group (treated with normal saline 10ml?kg-1), yang contrast group (treated wih qianlieshule 2.4g?kg-1), No.I decotion for prostatitis low-dose group (treated with10g?kg-1), middle-dose group (treated with 20g?kg-1), high-dose group (treated with 40g?kg-1). Rats in normal contrast group were injected subcutaneously with with 1 mL normal saline, and rats model in the other groups were done using self-immunitymodeling method, 30 days later the rats were retreated again,45 days later,they were administrated with drug mentioned above. 28 days later, prostate tissue of rats were resected for analysis of the amount of TGF-β1 and CTGF using immunohistochemical staining.Resultsthat in The levels of TGF-β1 and CTGF in prostatic tissue of the rest groups were much higher than that in normal contrast group, the difference was signif cant(P<0.05). Compared to that in the model contrast group, the amount of TGF-β1 and CTGF in prostatic tissueof the rest groups were signif cantly increased(P<0.05). The levels of TGF-β1 and CTGF in prostatic tissue of other groups were signif cantly changed (P<0.05) as compared with that in yang contrast group.ConclusionEvery dose group of No.I decotion for prostatitis all effectively inhibited the expressions of TGF-β1 and CTGF in prostatic tissue of CNP rat models and alleviate the f brosis severity of prostatic tissue, of which the middle and high dose groups were more effective.

prostatitis/drug thrapy; transforming growth factor beta1

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.08.004

R 697.33

資助: 江蘇省“六大人才高峰”項(xiàng)目（編號(hào)：WS-049）**

, E-mail: zengqq111@126.com