miR-361-5p對激素非依賴前列腺癌細胞PC3增殖、侵襲的影響*

劉大闖陶 陶許 斌陳恕求劉春輝張 磊盧 凱陳 明**韓從輝

1. 東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院泌尿外科（南京 210009）;

2. 東南大學(xué)附屬徐州市中心醫(yī)院泌尿外科; 3. 徐州醫(yī)學(xué)院附屬徐州臨床學(xué)院泌尿外科

·論 著·

miR-361-5p對激素非依賴前列腺癌細胞PC3增殖、侵襲的影響*

劉大闖1-3陶 陶1許 斌1陳恕求1劉春輝1張 磊1盧 凱1陳 明1**韓從輝2,3**

1. 東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院泌尿外科（南京 210009）;

2. 東南大學(xué)附屬徐州市中心醫(yī)院泌尿外科; 3. 徐州醫(yī)學(xué)院附屬徐州臨床學(xué)院泌尿外科

目的探討mirR-361-5p在激素非依賴性前列腺癌細胞PC3中的表達和作用。方法采用qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后的PC3中miRNA-361-5p的表達情況，用CCK-8和克隆形成實驗檢測轉(zhuǎn)染后的PC3細胞增殖能力，流式細胞儀檢測細胞周期和細胞凋亡的變化，Transwell實驗檢測細胞侵襲能力。結(jié)果qRT-PCR檢測結(jié)果顯示PC3中miR-361-5p含量低，脂質(zhì)體法有較高的轉(zhuǎn)染效率。CCK-8與克隆形成實驗表明在PC3中升高miR-361-5p能夠抑制前列腺癌細胞的活性和增殖能力。流式細胞檢測發(fā)現(xiàn)miR-361-5p可增加細胞阻滯在G0/G1期和凋亡的比例。Transwell實驗中，轉(zhuǎn)染miR-361-5p后細胞通過小室的數(shù)量明顯減少。結(jié)論 miR-361-5p能夠抑制PC3的增殖與侵襲能力，從而發(fā)揮抑癌的作用。

前列腺腫瘤; miR-361-5p; 細胞增殖; 腫瘤侵襲力

前列腺癌在美國發(fā)病率極高[1]，近年來前列腺癌在我國發(fā)病率及檢出率呈明顯上升趨勢[2]。但是前列腺癌的具體病因目前尚不完全清楚，并且最終都會向去勢抵抗性轉(zhuǎn)化，它使得疾病幾乎不可治愈[3]。微小RNA（microRNAs，miRNAs）屬于非編碼RNA（成熟的miRNAs的長度通常為18～25個核苷酸，不能編碼形成蛋白質(zhì)），主要通過在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達，在人類基因組中miRNAs 調(diào)控大約1/3的蛋白編碼基因[4]，控制細胞的凋亡、增殖、分化、代謝以及個體的發(fā)育和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及耐藥[5]。我們在microRNAs 芯片及后續(xù)的qRT-PCR驗證中發(fā)現(xiàn)，與激素依賴性前列腺癌相比，去勢抵抗性前列腺癌中miR-361-5p表達顯著降低。此前關(guān)于miR-361-5p在前列腺癌中的作用及miR-361-5p在去勢抵抗性前列腺癌表達缺失的機制尚不清楚。

材料與方法

一、材料

（一）細胞系

人前列腺癌細胞株P(guān)C3細胞由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所細胞資源中心提供。

（二）主要試劑

F12K-DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco 公司），胎牛血清（美國Hyclone公司），青霉素-鏈霉素雙抗生素（上海捷瑞生物公司），0.25%胰蛋白酶（美國Gibco公司），hsa-miR-361-5p mimics（5′-ACCCCUGGA GAUUCUGAUAAUU-3′） 與negative control（NC: 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′）（均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成），Opti-MEM培養(yǎng)基（美國Invitrogen 公司），脂質(zhì)體Lipofectamine 2000（美國Invitrogen 公司），Trizol（美國Invitrogen公司），Hairpin-itTM miRNAs RT-PCR Quantitation Kit（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司），CCK-8 Kit（中國碧云天生物技術(shù)研究所），結(jié)晶紫染色液（中國碧云天生物技術(shù)研究所），甲醇（廣東汕頭市西隴化工廠），細胞周期試劑盒（杭州聯(lián)科生物公司），annexin V-FITC/ PI細胞凋亡試劑盒（濟南UBio生物科技公司），Transwell小室（美國Milipore公司）。

二、實驗方法

（一）細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

以含10%胎牛血清、1%青-鏈雙抗的F12KDMEM完全培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2、95%飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以0.25%胰蛋白酶消化細胞，每周傳代2～3次。選擇對數(shù)生長期PC3細胞，轉(zhuǎn)染前1d，以0.25%胰蛋白酶消化細胞，90×g，離心3min，以無抗生素F12K-DMEM培養(yǎng)基制成單細胞懸液（6×105/孔）接種于的6孔培養(yǎng)板中（每孔含2mL不含抗生素的完全培養(yǎng)基），細胞密度約為5× 104/mL，24h內(nèi)在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)至細胞融合約60%左右可以用于轉(zhuǎn)染，將4μg hsa-miR-361-5p mimics和4μg NC分別加入250μL Opti-MEM 培養(yǎng)基中，吹勻；將5μL Lipofectamine 2000加入另一250μL Opti-MEM培養(yǎng)基，吹勻；5min后，將兩管液體混勻，室溫放置30min；將上述500μL 混合物加入6孔板中，搖勻；將6孔板置入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

（二）qRT-PCR檢測miR-361-5p的表達

轉(zhuǎn)染48h后Trizol法提取細胞總RNA，分光光度計檢測濃度，采用上海吉瑪SYBR Green染料法miRNA逆轉(zhuǎn)錄實時定量PCR試劑盒（Hairpin-itTMmiRNAs RT-PCR Quantitation Kit），按試劑盒的操作說明行MMLV酶逆轉(zhuǎn)錄和定量PCR檢測，以U6作為內(nèi)參，2-ΔΔCT法計算相對表達量。

（三）CCK-8實驗

轉(zhuǎn)染12h后用胰酶消化，通過血球計數(shù)板計數(shù)后，以每孔2 000個細胞接種于96孔培養(yǎng)板， 37℃、5% CO2培養(yǎng)。分別于24h、48h、72h和96h，向每孔加入10μL CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2h后用酶標儀測定在450nm處的吸光度，每組設(shè)5個復(fù)孔。

（四）克隆形成實驗

轉(zhuǎn)染48h后，同上消化、計數(shù)，將200個細胞/孔接種于6孔板中，用完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。每周更換兩次培養(yǎng)基，14d后待克隆形成，吸除培養(yǎng)基，用PBS 輕洗細胞2遍后，甲醇固定15min，吸除甲醇，加入0.2%結(jié)晶紫染色液染色20min，PBS輕洗3次，室溫自然晾干拍照獲得圖像，對超過50 個細胞的克隆進行計數(shù)。

（五）流式細胞儀檢測細胞周期

轉(zhuǎn)染48h后收集細胞，用PBS洗滌3次，加入預(yù)冷的75%乙醇（由0.01mol/L PBS稀釋無水乙醇配制），吹打均勻，封口膜密封，于-20℃固定24h以上，以PBS洗滌后加入細胞周期固定液重懸細胞，4℃避光孵育20min后上流式細胞儀檢測。

（六）流式細胞儀檢測細胞凋亡

轉(zhuǎn)染48h后收集細胞，PBS洗滌2次，用400μL 1×Binding Buffer懸浮細胞，濃度大約1×106cells/ mL，在細胞懸液中加入5μL Annexin V-FITC，輕輕混勻后于4℃避光條件下孵育15min，加入10μL PI后輕輕混勻于4℃避光條件下孵育5min，1h內(nèi)上機檢測。

（七）Transwell侵襲實驗

轉(zhuǎn)染48h后收集細胞，用無血清培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞密度為1×105個/mL，24 孔板每孔加入600μL 含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，將水化后預(yù)鋪Matrigel的Transwell小室放入，上層加入上述無血清培養(yǎng)基重懸的細胞100μL，培養(yǎng)12h，從培養(yǎng)箱中取出24孔板，將Transwell小室取出，用PBS 輕洗兩次，用棉簽將水吸干并小心擦去Transwell小室微孔膜內(nèi)層的Matrigel與細胞，將Transwell小室置于含95%甲醇600μL的24 孔板中，固定15min，將Transwell 小室放入PBS中，輕洗兩次，用棉簽將水吸干后，置于含結(jié)晶紫溶液600μL 的24 孔板中，染色20min，將Transwell 小室放置在載玻片上，切勿移動Transwell小室，在倒置顯微鏡下各取上、中、下、左、右5 個視野拍照，同時觀察下層液體中有無細胞掉下，如有的話，也需進行計數(shù)，計算細胞平均值。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

每組實驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件處理。組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、qRT-PCR檢測miR-361-5p的表達

分別設(shè)置空轉(zhuǎn)染組（MOCK組）、陰性對照（NC組）與hsa-miR-361-5p mimics（轉(zhuǎn)染組）3組。轉(zhuǎn)染48h后，qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，MOCK組及NC組PC3細胞miR-361-5p表達量均低，轉(zhuǎn)染組miR-361-5p表達量明顯升高，與NC組相比和與MOCK組相比差異均具統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），NC與MOCK組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染能成功導(dǎo)入miR-361-5p，具有較高的轉(zhuǎn)染效率，見圖1。

圖1 3組miR-361-5p的表達量比較

二、CCK-8實驗檢測細胞活性和增殖能力

轉(zhuǎn)染組與NC組相比細胞活性及增殖能力明顯降低，見圖2。

圖2 轉(zhuǎn)染組與NC組細胞活性及增殖能力比較

三、克隆形成實驗

轉(zhuǎn)染組與NC組相比細胞形成克隆的能力明顯降低，差異具統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖3。

四、流式細胞儀檢測細胞周期

各細胞周期分析，轉(zhuǎn)染組與NC組相比，細胞被阻滯在G1期的比例明顯增高，差異具統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖4。

五、流式細胞儀檢測細胞凋亡

轉(zhuǎn)染組與NC組相比，細胞發(fā)生凋亡的比例明顯增高，差異具統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）見圖5。

六、Transwell侵襲實驗

轉(zhuǎn)染組與NC組相比，穿透Transwell小室的細胞明顯減少，見圖6。

圖4 轉(zhuǎn)染組與NC組細胞被阻滯在G1期的比例比較

圖5 轉(zhuǎn)染組與NC組細胞發(fā)生凋亡的比例比較

圖6 轉(zhuǎn)染組與NC組細胞侵襲力比較

討 論

前列腺癌進展到去勢抵抗性（包括激素非依賴性和激素難治性前列腺癌）之后，其治療即陷入困境[6]。miRNA在物種進化過程中高度保守，以復(fù)雜的RNA表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)形式參與細胞的分化、發(fā)育、增殖、死亡等生命活動中一系列的重要進程[7]。作為分子生物學(xué)研究的熱點之一，miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用及其調(diào)控機制日益受到重視[8,9]。近年來miRNA與前列腺癌的研究也成為熱點，發(fā)現(xiàn)了與前列腺癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)的一些miRNA，其作用機制都需進一步明確[10,11]。

編碼miR361的基因位于Xq21.2，位于外顯子9和10之間的一個內(nèi)含子區(qū)CHM/choroideremia（無脈絡(luò)膜，無腦回畸形，又稱Rab護送蛋白1），產(chǎn)生兩種成熟的microRNA即miR-361-3p和miR-361-5p，其中miR-361-5p占主導(dǎo)[12]。有研究采用miRNA芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)在臨床無進展生存期、臨床治療失敗的前列腺癌以及良性前列腺增生各組患者中miR-361-5p表達存在著差異[13]。也有文獻報道m(xù)iR-361-5p可能與前列腺癌有關(guān)[14]。在轉(zhuǎn)移性前列腺癌中與非轉(zhuǎn)移性前列腺癌相比miR-361-5p明顯降低[15]。但miR-361-5p在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中起到什么樣的作用目前還沒有相關(guān)研究報道。關(guān)于miR-361-5p的研究也是剛剛起步，有報道證明miR-361-5p在人皮膚癌中靶向VEGFA抑制腫瘤生長和微血管形成[16]，miR-361在人類臍靜脈內(nèi)皮細胞中有與肽生長抑素的交互功能起到抗血管新生的作用[17]。但也有報道m(xù)iR-361-5p通過介導(dǎo)上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進宮頸癌的發(fā)生發(fā)展[18]，提示在不同的腫瘤中miR-361-5p可能起到不同的作用。miR-361也被報道與人類DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3有關(guān)，影響到人類DNA甲基化[19]。本實驗通過qRT-PCR實驗發(fā)現(xiàn)PC3中miR-361-5p含量低，轉(zhuǎn)染miR-361-5p mimics可人為的提高PC3細胞中miR-361-5p的含量，并驗證了該實驗具有較高的轉(zhuǎn)染效率。在成功轉(zhuǎn)染后CCK-8和克隆形成，實驗證明miR-361-5p可降低PC3細胞的活性和增殖能力。細胞的增殖與細胞的分裂速度、凋亡等有著密切的關(guān)系。細胞分裂速度減慢將明顯降低腫瘤的生長速度，我們的研究表明miR-361-5p能夠?qū)⒓毎铚贕0/G1期，阻止細胞的分裂，并證明miR-361-5p能夠促進PC3細胞凋亡，凋亡降低了細胞形成克隆的能力。Transwell侵襲實驗證明miR-361-5p能夠抑制PC3細胞的侵襲能力。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)miR-361-5p能夠調(diào)節(jié)PC3細胞的細胞周期及凋亡，可能通過這兩方面的作用進一步影響細胞增殖、侵襲等生物行為。但miR-361-5p的具體作用途徑尚不明了，其具體作用機制仍需要我們進一步研究和探索。

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（2014-01-28收稿）

Effects of miR-361-5p on proliferation and invasion in androgenindependent human prostate cancer cell line PC3*

Liu Dachuang1-3, Tao Tao1, Xu Bin1, Chen Shuqiu1,
Liu Chunhui1, Zhang Lei1, Lu Kai1, Chen Ming1**, Han Conghui2,3**
1. Department of Urology, Zhongda Hospital Aff liated with Southeast University, Nanjing 210009, China;
2. Department of Urology, Xuzhou Central Hospital Aff liated with Southeast University; 3. Department of Urology, Xuzhou
Clinical Institute Affliated with Xuzhou Medical College

: Chen Ming, Email: mingchenseu@gmail.com; Han Conghui, Email: conghuiseu@126.com

ObjectiveTo investigate the effects of mirR-361-5p on bilogical behaviors of androgen-independent human prostate cancer cellsPC3.MethodsThe expression of miR-361-5p in PC3 cells after transfection was detected by qRT-PCR. Cell viability and proliferation of PC3 cells trasfected with miR-361-5p were measured by Cell Counting Kit-8(CCK-8) assay and colony formation assay. Cell cycle and apoptosis of PC3 cells transfected with miR-361-5p were analyzed by f ow cytometry. The invasion ability of cell was evaluated by Transwell assay.ResultsThe results of qRTPCR showed that the expression of miR-361-5p in PC3 cells was low, indicating transfection eff ciency was higher using liposome method. Overexpression of miR-361-5p signif cantly inhibited the proliferation of PC3 cells. Cell cycle analysis of PC3 cells transfected with miR-361-5p showed that cell number in G0/G1 phase was high and cell apoptosis number waslow. MiR-361-5p signif cantly inhibited the number of cells migrated through Transwell chambers membrane.ConclusionThese findings suggest that miR-361-5p may be a tumor suppressor miR in PC3 and it can inhibit the proliferation and invasion ability of androgen-independent human prostate cancer cells.

prostatic neoplasms; miR-361-5p; cell proliferation; invasiveness

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.08.001

R 737.25

資助: 本課題受國家自然基金（81370849、81300472、81272557、81202034）、臨床醫(yī)學(xué)科技專項--新型臨床診療技術(shù)攻關(guān)（BL2013032）、教育部博士點基金（20120092120071）、江蘇省自然科學(xué)基金（BK2012336、BK2012647）、南京市科技發(fā)展項目（201201053）、東南大學(xué)新教師基本科研項目（3290002402）、江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計劃項目（CXZZ13_0133）和中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金資助資助
**共同通訊作者: 陳明, Email: mingchenseu@gmail.com; 韓從輝, E-mail: conghuiseu@126.com