中鏈脂肪酸對THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞膽固醇流出的影響

張新勝，楊雪艷，王 覲，張 永，劉英華，徐 慶，于曉明，劉 釗，薛長勇

解放軍總醫(yī)院 營養(yǎng)科，北京 100853

中鏈脂肪酸對THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞膽固醇流出的影響

張新勝，楊雪艷，王 覲，張 永，劉英華，徐 慶，于曉明，劉 釗，薛長勇

解放軍總醫(yī)院 營養(yǎng)科，北京 100853

目的觀察中鏈脂肪酸對THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞膽固醇流出的影響。方法采用WST-1試劑檢測200 μmmol/ L濃度的不同脂肪酸：辛酸(C8∶0)、癸酸(C10∶0)、豆蔻酸(C14∶0)、棕櫚酸(C16∶0)、硬脂酸(C18∶0)、油酸(C18∶1)、亞油酸(C18∶2)、α-亞麻酸(C18∶3)對THP-1細胞活性的影響；建立ApoA1介導(dǎo)的膽固醇流出細胞模型；不同濃度脂肪酸(0 μmmol/L、100 μmmol/L、200 μmmol/L)干預(yù)富集3H-膽固醇的THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞24 h后，用液體閃爍計數(shù)儀檢測并計算膽固醇的流出率。結(jié)果不同脂肪酸在200 μmmol/L濃度時，對THP-1細胞無細胞毒性作用(P＞0.05)；與空白組比較，ApoA1介導(dǎo)的細胞膽固醇流出明顯增加(P＜0.05)；隨著脂肪酸濃度的增加，C8∶0、C18∶0、C18∶1和C18∶3脂肪酸對細胞膽固醇流出影響差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；在200 μmmol/L濃度時，C8∶0和C18∶3脂肪酸與對照組比較更能促進細胞膽固醇的流出(P＜0.05)，且C8∶0脂肪酸對促進膽固醇流出的影響明顯高于C10∶0、C14∶0、C16∶0、C18∶0、C18∶1、C18∶2脂肪酸(P＜0.05)。結(jié)論中鏈脂肪酸C8∶0能夠促進THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞膽固醇的流出，且在200μmmol/L濃度時明顯優(yōu)于其他脂肪酸。

中鏈脂肪酸；脂肪酸；巨噬細胞；膽固醇流出

材料和方法

1 細胞及材料 THP-1細胞株由北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細胞庫提供；RPMI-1640培養(yǎng)基(改良型)、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)均購自Gibco公司；佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)、載脂蛋白A1(apolipoprotein，ApoA1)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)均購自Sigma公司；低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)購自上海生工生物工程有限公司；3H-膽固醇購自Perkin Elmer公司；6孔板、24孔板、96孔板及培養(yǎng)瓶購自Corning公司；WST-1細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒購自凱基生物公司；C8∶0、C10∶0、C14∶0、C16∶0、C18∶0、C18∶1、C18∶2、C18∶3脂肪酸均購自Sigma公司。

2 低密度脂蛋白的氧化修飾 用PBS將LDL終濃度調(diào)整為1.5 g/L，加入CuSO4，LDL終濃度為10 μm/L，置于37℃條件下充分氧化24 h后，裝入透析袋，用含200 μm/L乙二胺四乙酸的PBS液中透析48 h，過濾除菌，BCA法定量蛋白質(zhì)，用PBS調(diào)整蛋白質(zhì)濃度為1 g/L，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3 細胞培養(yǎng) THP-1細胞分別用含有10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液、RPMI-1640培養(yǎng)液，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)液中加入青霉素100 U/ml、鏈霉素100 g/ml。細胞離心換液后用培養(yǎng)液將細胞計數(shù)調(diào)整到4×105～ 8×105/ml(用計數(shù)板計量：細胞數(shù)/ml=100小格內(nèi)細胞個數(shù)/100×400×10 000×稀釋倍數(shù))，準(zhǔn)備用于下一步實驗。

4 干預(yù)脂肪酸的配制 稱量各種脂肪酸，用95%乙醇溶液配制成20 mmol/L的脂肪酸，再用無血清培養(yǎng)液(含20 mg/ml BSA)分別稀釋成2 mmol/L、1 mmol/L濃度脂肪酸干預(yù)物備用，干預(yù)脂肪酸加入培養(yǎng)孔內(nèi)最終濃度為200 μmmol/L、100 μmmol/L。

5 細胞活性的測定 按照WST-1細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒步驟，將培養(yǎng)好的THP-1細胞(細胞計數(shù)達到4×105～ 8×105/ml)，接種于96孔板置37℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱12 h，隨機分為18組(n=6)，包括空白組(無細胞+100 μl培養(yǎng)液)、細胞空白組(100 μl培養(yǎng)液)、200 μmmol/L及100 μmmol/L濃度下8種脂肪酸干預(yù)組(C8∶0、C10∶0、C14∶0、C16∶0、C18∶0、C18∶1、C18∶2、C18∶3)。37℃下孵育2 h。酶標(biāo)儀(波長450 nm)檢測每孔吸光度。每組吸光度值減去空白組吸光度值得到各組實際吸光度值。細胞存活率=(干預(yù)物組實際吸光度值/對照組實際吸光度值)×100%。

6 油紅O染色 在加有蓋玻片的6孔板中，加入THP-1細胞，PMA誘導(dǎo)分化成泡沫細胞，吸掉培養(yǎng)液，PBS清洗3次后，50%異丙醇固定1 min，油紅染色10 min，水性封片劑封片，顯微鏡下觀察泡沫細胞形態(tài)。

7 膽固醇流出細胞模型的建立 將培養(yǎng)好的THP-1細胞接種于24孔板，同時每孔加入50 ng/ml PMA培養(yǎng)24 h，使其誘導(dǎo)分化成巨噬細胞。PBS液洗滌細胞，再加入Ox-LDL(50 μg/ml)、3H-膽固醇(2 μCi/ml，溶于乙醇，乙醇總濃度＜0.2%)、含10% FBS培養(yǎng)液共同孵育48 h后，PBS液再洗滌細胞后，隨機分為2組(n=12)：空白組只加入無血清的培養(yǎng)液、對照組加入無血清含10 μg/ml ApoA1培養(yǎng)液，培育12 h后，用閃爍計數(shù)法檢測培養(yǎng)液和細胞的3H-膽固醇放射活性每分鐘計數(shù)值(Cpm值)。膽固醇流出率=(培養(yǎng)液Cpm值/總Cpm值)×100%，其中總Cpm值=(培養(yǎng)液Cpm值+細胞Cpm值)。

8 膽固醇流出率的測定 將培養(yǎng)好的THP-1細胞，接種于24孔板，按照上述方法，誘導(dǎo)分化成巨噬細胞，富集3H-膽固醇后，隨機分為17組(n=7)，包括對照組、200 μmmol/L及100 μmmol/ L濃度下8種脂肪酸干預(yù)組(C8∶0、C10∶0、C14∶0、C16∶0、C18∶0、C18∶1、C18∶2、C18∶3)，按照分組加入不同脂肪酸干預(yù)物(其中對照組加入含2 mg/ml BSA的培養(yǎng)液)培育24 h后，用PBS液洗滌細胞，再分別加入無血清含10 μg/ml ApoA1培養(yǎng)液中培育12 h，用閃爍計數(shù)法檢測培養(yǎng)液和細胞的Cpm值，計算膽固醇流出率。

9 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)均以±s表示。多組之間數(shù)據(jù)進行多因素方差分析及單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 THP-1巨噬細胞源性泡沫化 THP-1細胞由PMA誘導(dǎo)分化為泡沫細胞，經(jīng)油紅O染色后，發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)有大量脂滴的存在，符合泡沫細胞的形態(tài)。見圖1。

2 200 μmmol/L濃度不同脂肪酸對THP-1細胞活性的影響 不同脂肪酸在200 μmmol/L濃度下對THP-1細胞無細胞毒性作用，各組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見圖2。

圖 1 THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞油紅O染色Fig.1 Oil red O staining of THP-1 macrophage-derived foam cells (×40)

圖 2 不同脂肪酸對THP-1細胞活性的影響Fig.2 Effects of different fatty acids on cell viability (×40)

3 膽固醇流出細胞模型的建立 與空白組比較，對照組(+ApoA1)THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞膽固醇流出顯著增加(P＜0.05)，見圖3。ApoA1介導(dǎo)的膽固醇流出明顯增加，提示膽固醇流出細胞模型復(fù)制成功。

4 中鏈脂肪酸對THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞膽固醇流出的影響 多因素方差分析發(fā)現(xiàn)，隨著脂肪酸濃度的增加(0 ～ 200 μmmol/L)，C8∶0、C18∶0、C18∶1和C18∶3脂肪酸對膽固醇的流出差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，特別是C8∶0脂肪酸具有隨著其濃度增加、膽固醇流出增加的趨勢。當(dāng)不同的脂肪酸都在相同的200 μmmol/L濃度時，C8∶0和C18∶3脂肪酸促進膽固醇的流出，且顯著高于對照組(P＜0.05)。此外，C8∶0對促進膽固醇流出的影響顯著高于C10∶0、C14∶0、C16∶0、C18∶0、C18∶1、C18∶2脂肪酸(P＜0.05)。見表1。

圖 3 ApoA1介導(dǎo)的細胞膽固醇流出Fig.3 Effect of ApoA1 on cholesterol eff l ux

表1 不同脂肪酸對THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞的膽固醇流出的影響Tab. 1 Effects of different fatty acids on cholesterol eff l ux in THP-1 macrophages-derived foam cells

討論

巨噬細胞內(nèi)膽固醇大量聚集形成泡沫細胞，在炎性因子的作用下沉積于血管壁下，這一過程是AS的早期病理基礎(chǔ)。而RCT能夠清除細胞內(nèi)多余的膽固醇，減緩巨噬細胞泡沫化進程，延緩AS的發(fā)生和發(fā)展。膽固醇流出是RCT過程中的限速步驟，已成為防治AS研究的熱點。

膳食脂肪酸被認為是影響AS發(fā)生、發(fā)展重要的營養(yǎng)因素，研究發(fā)現(xiàn)飽和脂肪酸增加血清低密度脂蛋白膽固醇水平，進而促進AS的發(fā)生[1]。而不飽和脂肪酸能夠?qū)笰S的發(fā)展，如亞油酸能夠降低血漿LDL-C水平而對抗AS形成，DHA或EPA能夠降低動脈粥樣硬化疾病的心血管并發(fā)癥[1,5-6]。MCFA作為一種特殊的飽和脂肪酸，具有快速代謝、減少脂肪組織富集以及增加機體能量消耗的特點，近年來多數(shù)研究已經(jīng)表明，MCFA能夠減輕體質(zhì)量，減少脂肪的堆積[7-8]。筆者研究團隊發(fā)現(xiàn)，MCFA能夠改善高膽固醇血癥小鼠血清膽固醇、三酰甘油、LDL-C及HDL-C水平，促進了糞便的中性固醇和膽汁酸的排泄[4]。提示MCFA能夠改善膽固醇代謝，防治AS的發(fā)生，進而預(yù)防和改善心血管疾病。本研究以THP-1巨噬細胞為研究對象，首先確認了在200 μmmol/L濃度下不同脂肪酸對THP-1巨噬細胞無細胞毒性作用，進一步膽固醇流出實驗發(fā)現(xiàn)，隨著脂肪酸濃度的增加(0 ～200 μmmol/L)，C8∶0、C18∶0、C18∶1和C18∶3脂肪酸對膽固醇流出的影響有顯著差異，特別是C8∶0脂肪酸具有隨著其濃度增加、膽固醇流出增加的趨勢，而飽和脂肪酸C18∶0在100 μmmol/L濃度時，對膽固醇流出表現(xiàn)出抑制作用，說明了長鏈飽和脂肪酸對AS的不利影響。研究報道C18∶3能夠促進膽固醇流出而降低泡沫細胞膽固醇聚集[9]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，多不飽和脂肪酸C18∶3在200μmmol/L濃度時促進膽固醇的流出。Xie等[10]動物實驗發(fā)現(xiàn)，辛酸(C8∶0)與油酸(C18∶1)及亞油酸(C18∶2)相比能夠降低肝ApoB、三酰甘油及膽固醇的分泌。Wein等[11]研究發(fā)現(xiàn)，MCFA可以降低大鼠空腹膽固醇水平，表明了MCFA在膽固醇代謝方面優(yōu)于長鏈脂肪酸。這些研究結(jié)果表明，MCFA在膽固醇代謝方面較其他脂肪酸具有顯著優(yōu)勢。本研究在200 μmmol/L濃度時比較不同脂肪酸，發(fā)現(xiàn)C8∶0和C18∶3脂肪酸促進THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞膽固醇的流出，此外，C8∶0對促進膽固醇流出的影響明顯高于C10∶0、C14∶0、C16∶0、C18∶0、C18∶1、C18∶2脂肪酸。

有關(guān)研究報道C18∶3促進膽固醇流出的機制是促進ABCA1、ABCG1及SR-BI表達而增加ApoA1介導(dǎo)的膽固醇流出[12]。目前已知有三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體超家族(ABCA1、ABCG1、 ABCG5、ABCG8)、7α-羥化酶(CYP7A1)及SR-BI等參與膽固醇RCT過程，并受核受體肝X受體(LXR-α)及過氧化物酶增殖物激活受體-α、(PPAR-α)調(diào)節(jié)。有關(guān)中鏈脂肪酸C8∶0如何促進膽固醇的流出還需要我們進一步探討。本實驗只是通過細胞實驗觀察到中鏈脂肪酸C8∶0促進膽固醇流出效應(yīng)，是否對于動物或人群同樣具有效應(yīng)，也需要進一步研究。

1 Mensink RP， Zock PL， Kester AD， et al. Effects of dietary fatty acids and carbohydrates on the ratio of serum total to HDL cholesterol and on serum lipids and apolipoproteins： a meta-analysis of 60 controlled trials［J］. Am J Clin Nutr， 2003， 77（5）： 1146-1155.

2 Xue C， Liu Y， Wang J， et al. Consumption of medium- and longchain triacylglycerols decreases body fat and blood triglyceride in Chinese hypertriglyceridemic subjects［J］. Eur J Clin Nutr， 2009，63（7）： 879-886.

3 徐慶，劉英華，王覲，等.中長鏈脂肪酸食用油對高甘油三酯血癥患者脂代謝的影響［J］.軍醫(yī)進修學(xué)院學(xué)報，2009，30（4）：511-513.

4 Xu Q， Xue C， Zhang Y， et al. Medium-chain fatty acids enhanced the excretion of fecal cholesterol and cholic acid in C57BL/6J mice fed a cholesterol-rich diet［J］. Biosci Biotechnol Biochem， 2013， 77（7）：1390-1396.

5 Wijendran V， Hayes KC. Dietary n-6 and n-3 fatty acid balance and cardiovascular health［J］. Annu Rev Nutr， 2004， 24： 597-615.

6 Mozaffarian D， Rimm EB. Fish intake， contaminants， and human health： evaluating the risks and the benefits［J］. JAMA， 2006，296（15）：1885-1899.

7 Ferreira L， Lisenko K， Barros B， et al. Influence of medium-chain triglycerides on consumption and weight gain in rats： a systematic review［J］. J Anim Physiol Anim Nutr （Berl）， 2014， 98（1）： 1-8.

8 Rego Costa AC， Rosado EL， Soares-Mota M. Influence of the dietary intake of medium chain triglycerides on body composition， energy expenditure and satiety： a systematic review［J］. Nutr Hosp，2012， 27（1）： 103-108.

9 Zhang J， Kris-Etherton PM， Thompson JT， et al. Alpha-linolenic acid increases cholesterol efflux in macrophage-derived foam cells by decreasing stearoyl CoA desaturase 1 expression： evidence for a farnesoid-X-receptor mechanism of action［J］. J Nutr Biochem，2012， 23（4）： 400-409.

10 Xie C， Woollett LA， Turley SD， et al. Fatty acids differentially regulate hepatic cholesteryl ester formation and incorporation into lipoproteins in the liver of the mouse［J］. J Lipid Res， 2002， 43（9）：1508-1519.

11 Wein S， Wolffram S， Schrezenmeir J， et al. Medium-chain fatty acids ameliorate insulin resistance caused by high-fat diets in rats［J］. Diabetes Metab Res Rev， 2009， 25（2）： 185-194.

12 K?mmerer I， Ringseis R， Biemann R， et al. 13-hydroxy linoleic acid increases expression of the cholesterol transporters ABCA1， ABCG1 and SR-BI and stimulates apoA-I-dependent cholesterol efflux in RAW264.7 macrophages［J］. Lipids Health Dis， 2011， 10： 222.

Effects of medium-chain fatty acids on cholesterol efflux in THP-1 macrophages -derived foam cells

ZHANG Xin-sheng, YANG Xue-yan, WANG Jin, ZHANG Yong, LIU Ying-hua, XU Qing, YU Xiao-ming, LIU Zhao, XUE Changyong
Department of Nutrition, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

XUE Chang-yong. Email: cnxcy@163.com

ObjectiveTo observe the effect of medium-chain fatty acids on cholesterol eff l ux in THP-1 macrophages-derived foam cells.MethodsWST-1 were used to detect the effect of different fatty acids (in the presence of 200 μmmol/L) on the cell viability of THP-1, including caprylic acid (C8∶0), capric acid (C10∶0), myristic Acid (C14∶0), palmitic acid (C16∶0), stearic acid (C18∶0), oleic acid (C18∶1), linoleic acid (C18∶2) and alpha linolenic acid (C18∶3). The cell model of cholesterol eff l ux that mediated by ApoA1 was established. Different fatty acids (0 μmmol/L, 100 μmmol/L and 200 μmmol/L) were used to intervene the THP-1 macrophages-derived foam cells of enriched3H-cholesterol, then after 24 hours, the rate of cholesterol eff l ux were determined by the liquid scintillation.ResultsIn the presence of 200 μmmol/L, different fatty acids showed no adverse effect on the viability of THP-1 cell line (P＞0.05). Compared with the blank group, ApoA1 mediated cholesterol eff l ux was signif i cantly higher (P＜0.05). With the increase of concentration of fatty acids, C8∶0, C18∶0, C18∶2 and C18∶3 showed signif i cant effects on cholesterol eff l ux (P＜0.05). In the concentration of 200 μmmol/L, C8∶0 and C18∶3 fatty acids signif i cantly promoted cholesterol eff l ux comparing with control group (P＜0.05), furthermore, C8∶0 fatty acid promoted cholesterol eff l ux was signif i cantly higher than in C10∶0, C14∶0, C16∶0, C18∶0, C18∶1 and C18∶2 fatty acids groups (P＜0.05).ConclusionThe medium-chain fatty acid C8∶0 can increase cholesterol eff l ux in THP-1 macrophages-derived foam cells and is obviously higher than that of other fatty acids when its concentration is 200 μmmol/L.

medium-chain fatty acids; fatty acids; macrophages; cholesterol eff l ux

R 589.2

A

2095-5227(2014)12-1245-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.12.019

時間：2014-09-18 09:41

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20140918.0941.001.html

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是導(dǎo)致心血管疾病發(fā)生、發(fā)展的主要病理基礎(chǔ)，而引起AS的主要原因就是血膽固醇水平的升高，進而導(dǎo)致病變血管處膽固醇的堆積，巨噬細胞過度荷脂形成泡沫細胞，沉積于動脈壁形成早期的粥樣斑塊。膽固醇的逆轉(zhuǎn)運(reverse cholesterol transport，RCT)過程可將細胞內(nèi)多余的膽固醇從細胞中流出并轉(zhuǎn)移至高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)，再經(jīng)血液循環(huán)轉(zhuǎn)運到肝進行代謝。因此，巨噬細胞的RCT對動脈粥樣硬化的形成起著關(guān)鍵的作用，也是目前認為對抗AS發(fā)生的主要機制[1]。膳食脂肪酸被認為是影響AS發(fā)生、發(fā)展的重要營養(yǎng)因素，而中鏈脂肪酸(medium chain fatty acids，MCFA)為一種特殊的飽和脂肪酸，是由8 ～ 12個碳原子構(gòu)成的脂肪酸，主要來源于母乳、牛奶及其制品、棕櫚仁油和椰子油等，最常見的MCFA有C8∶0和C10∶0脂肪酸。MCFA與健康的關(guān)系日益受到重視，臨床試驗研究發(fā)現(xiàn)，MCFA除了能夠降低體質(zhì)量、改善體脂外，還能夠顯著降低高脂血癥患者三酰甘油和膽固醇水平[2-3]。動物實驗研究同樣發(fā)現(xiàn)，MCFA能夠改善高膽固醇血癥小鼠血清膽固醇、三酰甘油、LDL-C及HDL-C水平，還能促進糞便的中性固醇和膽汁酸的排泄[4]。因此，MCFA對膽固醇代謝具有明顯的調(diào)節(jié)效應(yīng)，本文以THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞為研究對象，與其他脂肪酸比較，觀察中鏈脂肪酸對THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞膽固醇流出的影響，探討MCFA在防治AS發(fā)生及發(fā)展中的作用。

2014-05-14

國家自然科學(xué)基金項目(81172667)

Supported by the National Natural Science Foundation of China(8117 2667)

張新勝，男，在讀碩士，主治醫(yī)師。Email: zhangxinsheng198431@126.com

薛長勇，男，碩士，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主任。Email: cnxcy@163.com