通心絡(luò)對早期糖尿病腎病大鼠腎功能及腎組織NO/eNOS表達(dá)的影響

周盛楠 高彥彬 李嬌陽 鄒大威 朱智耀 張娜 王馨瑤 李光超 崔方強(qiáng) 劉靜

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病發(fā)展過程中最常見的慢性微血管并發(fā)癥之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，截止2013年10月全球有3.47 億人患有糖尿病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，25%～40%的糖尿病患者伴隨糖尿病腎病。在西方國家，糖尿病腎病是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因［1］。由于DN 發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，目前尚無有效藥物阻止DN 患者腎功能的進(jìn)行性衰減，一旦發(fā)展至終末期腎病則需透析或腎移植治療。因此，探求糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制，尋求有效的藥物成為當(dāng)前糖尿病學(xué)界及腎臟病學(xué)界研究的熱點(diǎn)。臨床及實(shí)驗(yàn)研究表明，DN 早期腎小球高灌注、高壓力、高濾過狀態(tài)可導(dǎo)致腎小球肥大，并與腎小球超微結(jié)構(gòu)的改變密切相關(guān)［2-3］。引起腎小球高灌注、高壓力、高濾過的機(jī)制尚未闡明，目前研究認(rèn)為內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)蛋白表達(dá)增強(qiáng)引起的一氧化氮(nitric oxid，NO)生成增多參與DN 早期腎小球肥大及腎小球高濾過的發(fā)展過程［4］。本課題采用高脂飼料聯(lián)合鏈脲佐菌素建立早期DN 大鼠模型，通過檢測腎組織中NO 含量及eNOS 蛋白的表達(dá)，探討中藥通心絡(luò)治療糖尿病腎病的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF 級8 周齡雄性SD 大鼠40 只，體重180～220 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號:SCXK(京)2012-0001。

1.2 藥品

通心絡(luò)超微粉(主藥為人參、赤芍、大棗、檀香、降香、水蛭、全蝎、土鱉蟲、蜈蚣、蟬蛻、乳香、冰片等)，產(chǎn)品批號:20130108，河北以嶺醫(yī)藥研究院有限公司;纈沙坦膠囊(商品名:代文，規(guī)格:80 mg/粒，產(chǎn)品批號:X1448，批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字H20040217，北京諾華制藥有限公司)

1.3 主要試劑

Sigma 鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)，貨號:SO130-1g，購自北京首醫(yī)臨床技術(shù)中心;檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖液(0.1 M，pH=4.4，購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司);大鼠尿微量白蛋白酶聯(lián)免疫試劑盒(批號:19，購自北京欣博盛生物科技有限公司);NO 檢測試劑盒(批號:A012，南京建成科技有限公司);肌酐測定試劑盒(批號:4501-40-2013，上?？迫A生物工程有限公司);大鼠尿素氮試劑盒(批號:4217-39-2013，上?？迫A生物工程有限公司)。

1.4 主要儀器

電子天平(YP601N，上海精密科學(xué)儀器有限公司);血糖儀［CareSense POP GM505EA，愛科來國際商貿(mào)(上海)有限公司］;酶標(biāo)儀(Multiskan MK3，Thermo Scientific);全自動(dòng)生化分析儀(卓越320、330，上?？迫A實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司);電泳儀(ELITE200，Wealtec Corp，USA);小型垂直電泳槽(V-GES，Wealtec Corp，USA)等。

1.5 模型建立與分組給藥

本實(shí)驗(yàn)采用高脂飼料聯(lián)合小劑量STZ 法建立DN 大鼠模型:SPF 級雄性SD 大鼠40 只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，依據(jù)體重隨機(jī)分為正常對照組10 只，予以普通飼料。造模組30 只，予以高脂飼料。4 周后所有大鼠均禁食(不禁水)12 小時(shí)后，造模組大鼠腹腔注射1% STZ 35 mg/kg(以pH 為4.2～4.4 的0.1 mol/L檸檬酸緩沖液配置)，空白組注射等劑量的檸檬酸緩沖液為對照，72 小時(shí)后經(jīng)大鼠尾靜脈采血測血糖，以空腹血糖大于16.7 mmol/L。將成模大鼠隨機(jī)分為模型組，纈沙坦組及通心絡(luò)組。次日開始給藥，西藥組予纈沙坦10 mg/(kg·d)灌胃，通心絡(luò)組予通心絡(luò)超微粉0.4 g/(kg·d)灌胃，空白組及模型組予等體積蒸餾水灌胃，連續(xù)灌胃8 周，實(shí)驗(yàn)過程中無大鼠死亡。

1.6 標(biāo)本采集

灌胃期間，每月動(dòng)態(tài)監(jiān)測大鼠血糖。于治療4周、8 周各時(shí)點(diǎn)，將各組大鼠置于代謝籠中收集24小時(shí)尿液并記錄尿量，用于檢測24 小時(shí)尿微量白蛋白排泄率(urinary albumin excretion，UAER)。于治療4 周、8 周各時(shí)點(diǎn)，剪尾取血，分離血清并于-20℃冰箱保存，用于檢測血肌酐、血尿素氮，并計(jì)算內(nèi)生肌酐清除率。各組大鼠連續(xù)灌胃8 周，禁食12 小時(shí)，用10%水合氯醛按0.35 ml/kg 注射麻醉，取出雙側(cè)腎臟，左腎稱重后置于4%多聚甲醛中固定，右腎液氮凍存。血液標(biāo)本及液氮速凍后的腎組織-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 觀察指標(biāo)及方法

(1)血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)，采用尾靜脈取血，用CareSense POP 血糖儀及血糖試紙檢測。(2)血肌酐(serum creatinine，SCr)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)，采用卓越全自動(dòng)生化儀及相應(yīng)試劑盒檢測。并計(jì)算內(nèi)生肌酐清除率(creatinine clearance rate，Ccr):內(nèi)生肌酐清除率=尿肌酐×24 小時(shí)總尿量(按毫升計(jì))÷血肌酐÷1440 分鐘÷體質(zhì)量(按克計(jì))×100，單位為ml/(min·g/100)。(3)24 小時(shí)UAER 采用ELISA 酶聯(lián)免疫學(xué)方法檢測，操作步驟見試劑盒說明書。(4)腎重及體質(zhì)量，采用電子天平稱量，腎重指數(shù)=腎重/體質(zhì)量。(5)腎組織NO 含量，采用硝酸酶還原法檢測，按試劑盒說明書操作。(6)腎組織eNOS 蛋白表達(dá)，采用Western-blot 法，每組隨機(jī)選取4 個(gè)樣本。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 通心絡(luò)對各組大鼠FBG 的影響

經(jīng)Tamhane's T2 檢驗(yàn)，4 周及8 周大鼠血糖值，與空白組比較，模型組大鼠于治療4 周及8 周血糖明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與模型組比較，通心絡(luò)組及纈沙坦組大鼠于治療4 周及8 周血糖無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。通心絡(luò)組與纈沙坦組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。

2.2 通心絡(luò)對各組大鼠UAER 的影響

經(jīng)檢驗(yàn)，治療4 周大鼠UAER 四組間有差別(F=521.663，P=0.000)，且方差齊。經(jīng)LSD 檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與空白組比較，模型組大鼠UAER 顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與模型組比較，通心絡(luò)大鼠UAER 顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，纈沙坦組大鼠UAER 顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。通心絡(luò)及纈沙坦組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。治療8 周大鼠UAER 四組間有差別(F=391.440，P=0.000)，且方差不齊。經(jīng)Tamhane’s T2 檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與空白組比較，模型組大鼠UAER 顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與模型組比較，通心絡(luò)大鼠UAER 顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，纈沙坦組大鼠UAER 顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。通心絡(luò)及纈沙坦組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。

表1 大鼠血糖及尿微量白蛋白比較(±s，n=10)

表1 大鼠血糖及尿微量白蛋白比較(±s，n=10)

組名 FBG (mmol/L) UAER (mg/24h)空白組4 周 5.84±0.44 0.303±0.025 8 周 5.90±0.55 0.338±0.030模型組4 周 27.01±4.77 1.890±0.159 8 周 28.00±4.67 2.577±0.171通心絡(luò)組4 周 26.46±2.90 1.692±0.090 8 周 26.54±2.48 2.228±0.107纈沙坦組4 周 26.33±1.77 1.697±0.085 8 周28.53±1.48 2.230±0.253

2.3 通心絡(luò)對各組大鼠SCr 的影響

經(jīng)檢驗(yàn)，治療4 周大鼠SCr 四組間含量有差別(F=65.446，P=0.000)，且方差不齊。經(jīng)Tamhane's T2 檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與空白組比較，模型組大鼠SCr 顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與模型組比較，通心絡(luò)大鼠SCr 顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，纈沙坦組大鼠SCr 顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。通心絡(luò)及纈沙坦組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。治療8 周大鼠SCr 四組間含量有差別(F=121.644，P=0.000)，且方差齊。經(jīng)LSD 檢驗(yàn)，與空白組比較，模型組大鼠SCr 顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與模型組比較，通心絡(luò)大鼠SCr 顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，纈沙坦組大鼠SCr 顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。通心絡(luò)及纈沙坦組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表2。

2.4 通心絡(luò)對各組大鼠BUN 的影響

經(jīng)檢驗(yàn)，治療4 周及8 周大鼠BUN 四組間含量有差別(4 周:F=74.42，P=0.000;8 周:F=177.264，P=0.000)，且方差均不齊。經(jīng)Tamhane's T2 檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與空白組比較，模型組大鼠BUN 顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與模型組比較，通心絡(luò)及纈沙坦組大鼠BUN 顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。通心絡(luò)及纈沙坦組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表2。

2.5 通心絡(luò)對各組大鼠Ccr 的影響

經(jīng)檢驗(yàn)，治療4 周及8 周大鼠Ccr 四組間有差別(4 周:F=36.560，P=0.000;8 周:F=106.348，P=0.000)，且方差均齊。經(jīng)LSD 檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與空白組比較，模型組大鼠Ccr 顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與模型組比較，通心絡(luò)組大鼠Ccr顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，纈沙坦組大鼠Ccr 顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。通心絡(luò)及纈沙坦組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表2。

表2 大鼠血肌酐、尿素氮及內(nèi)生肌酐清除率比較(±s，n=10)

表2 大鼠血肌酐、尿素氮及內(nèi)生肌酐清除率比較(±s，n=10)

組名 SCr(μmol/L)BUN(mmol/L)Ccr ml/(min·g/100)空白組4 周 29.60±1.84 5.41±0.67 0.777±0.108 8 周 30.10±1.67 5.28±0.70 0.789±0.073模型組4 周 40.20±2.49 9.64±0.90 1.328±0.115 8 周 46.40±2.07 12.00±0.99 1.673±0.132通心絡(luò)組4 周 35.60±0.70 7.18±0.50 1.135±0.129 8 周 39.90±2.51 8.25±0.32 1.427±0.093纈沙坦組4 周 37.00±1.41 7.20±0.33 1.182±0.135 8 周40.80±1.32 8.45±0.35 1.534±0.162

2.6 通心絡(luò)對各組大鼠腎重的影響

經(jīng)檢驗(yàn)，治療8 周大鼠腎重四組間含量有差別(F=63.962，P=0.000)，且方差不齊。經(jīng)Tamhane’s T2 檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與空白組比較，模型組大鼠腎重顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與模型組比較，通心絡(luò)及纈沙坦組大鼠腎重顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。通心絡(luò)及纈沙坦組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表3。

2.7 通心絡(luò)對各組大鼠腎重指數(shù)的影響

經(jīng)檢驗(yàn)，治療8 周大鼠腎重指數(shù)四組間含量有差別(F=214.083，P=0.000)，且方差不齊。經(jīng)Tamhane’s T2 檢驗(yàn)，與空白組比較，模型組大鼠腎重指數(shù)顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與模型組比較，通心絡(luò)及纈沙坦組大鼠腎重指數(shù)顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。通心絡(luò)及纈沙坦組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表3。

表3 大鼠治療8 周腎重、腎重指數(shù)比較(±s，n=10)

表3 大鼠治療8 周腎重、腎重指數(shù)比較(±s，n=10)

組名 腎重(g) 腎重指數(shù)(×10 －3)1.23±0.07 2.32±0.09模型組 2.13±0.25 5.60±0.51通心絡(luò)組 1.79±0.10 4.31±0.21纈沙坦組空白組1.82±0.09 4.48±0.20

2.8 通心絡(luò)對各組大鼠腎組織NO 的影響

經(jīng)檢驗(yàn)，治療8 周大鼠腎組織NO 含量四組間有差別(F=9.735，P=0.000)，且方差齊。經(jīng)LSD檢驗(yàn)，與空白組比較，模型組大鼠腎組織NO 含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與模型組比較，通心絡(luò)組大鼠腎組織NO 含量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，纈沙坦組大鼠腎組織NO顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。通心絡(luò)及纈沙坦組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表4。

2.9 通心絡(luò)對各組大鼠腎組織eNOS 蛋白表達(dá)量的影響

經(jīng)檢驗(yàn)，治療8 周大鼠腎組織eNOS 蛋白表達(dá)量四組間有差別(F=8.748，P=0.002)，且方差齊。經(jīng)LSD 檢驗(yàn)，與空白組比較，模型組大鼠腎組織eNOS 蛋白表達(dá)量顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與模型組比較，通心絡(luò)組大鼠腎組織eNOS 蛋白表達(dá)量顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，纈沙坦組大鼠腎組織eNOS 蛋白表達(dá)量顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。通心絡(luò)及纈沙坦組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表4。由圖1可知，模型組eNOS 灰度較空白組顯著增加，纈沙坦組及通心絡(luò)組較模型組顯著減少。

表4 大鼠治療8 周腎組織NO 含量及eNOS 蛋白表達(dá)(±s)

表4 大鼠治療8 周腎組織NO 含量及eNOS 蛋白表達(dá)(±s)

組名 NO (μmol/gprot，n=10) eNOS/β-actin (n=4)1.36±0.17 0.63±0.08模型組 1.99±0.42 1.37±0.06通心絡(luò)組 1.55±0.17 0.83±0.30纈沙坦組空白組1.63±0.23 1.00±0.28

圖1 各組大鼠腎組織eNOS 蛋白表達(dá)

3 討論

3.1 NO 及eNOS 對早期糖尿病腎病的影響

DN 發(fā)病涉及遺傳因素、糖脂代謝紊亂、血流動(dòng)力學(xué)改變、氧化應(yīng)激、腎間質(zhì)纖維化等環(huán)節(jié)［5］。DN早期，腎小球高灌注造成的腎小球肥大是導(dǎo)致DN腎小球硬化的主要原因之一。內(nèi)皮衍生的血管舒張因子NO 是介導(dǎo)DN 早期高濾過發(fā)生發(fā)展的重要介質(zhì)。高血糖、脂代謝紊亂、高血壓等因素可促進(jìn)一氧化氮合酶(NOS)表達(dá)增加，進(jìn)而促進(jìn)NO 釋放增多，NO 同時(shí)作用于出入球小動(dòng)脈，但出球小動(dòng)脈對NO 不甚敏感。因此，大量產(chǎn)生的NO 使入球小動(dòng)脈舒張，腎血流量增加，造成腎小球率過濾增加［4，6-7］。研究發(fā)現(xiàn)體內(nèi)有三種NOS，分別為神經(jīng)型一氧化氮合酶(nNOS)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)及內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)。其中eNOS 主要在腎血管內(nèi)皮中表達(dá)，依靠Ca+/CaM 激活，經(jīng)過復(fù)雜的信號傳導(dǎo)通路引起NO 釋放增加，促進(jìn)入球小動(dòng)脈舒張，腎血流量增加，進(jìn)而引起腎小球高濾過［8］。

3.2 腎絡(luò)瘀滯是DN 主要的病理環(huán)節(jié)

本研究組認(rèn)為消渴病腎病是消渴病日久，久病入絡(luò)，出現(xiàn)的腎系并發(fā)癥，主要表現(xiàn)為尿濁、水腫、腰痛、癃閉、關(guān)格，其病位在腎，繼發(fā)于消渴病，因此稱為消渴病腎病。絡(luò)病是貫穿于消渴病腎病始終的病理狀態(tài)。發(fā)病之初，病在肝腎，氣陰兩虛，腎絡(luò)瘀滯。病程遷延，陰損及陽，脾腎虛衰，腎絡(luò)瘀阻。病變晚期，五臟受損，腎絡(luò)瘀結(jié)。消渴病腎病的基本病理環(huán)節(jié)為腎絡(luò)瘀滯，腎絡(luò)瘀阻、腎絡(luò)瘀結(jié)［9］。在消渴病腎病病程中，“瘀”貫穿此中。因此，化瘀通絡(luò)為消渴病腎病重要的治療法則。本實(shí)驗(yàn)選用通心絡(luò)干預(yù)早期糖尿病腎病模型大鼠。通心絡(luò)是根據(jù)中醫(yī)絡(luò)病理論研制而成的中藥復(fù)方，由人參、水蛭、全蝎、土鱉蟲、蜈蚣、蟬蛻、赤芍及冰片等組成。諸藥合用，益氣通絡(luò)，有活血暢脈之佳效，無耗氣傷血之弊，使氣旺血行，絡(luò)脈暢通。前期臨床及實(shí)驗(yàn)研究均顯示，通心絡(luò)可有效降低、消除糖尿病腎病尿微量白蛋白及改善臨床癥狀，對控制糖尿病腎病進(jìn)展具有治療作用［10-12］。

3.3 通心絡(luò)可有效改善糖尿病腎病早期腎小球高濾過狀態(tài)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠24小時(shí)UAER 及Ccr 在治療8 周處于高水平，腎重及腎重指數(shù)顯著增加，腎組織NO 含量增加，eNOS 蛋白表達(dá)增強(qiáng)，說明DN 大鼠于8 周腎小球處于高濾過狀態(tài)。經(jīng)過藥物干預(yù)，與模型組大鼠比較，治療組大鼠24 小時(shí)UAER 及Ccr 顯著降低，腎重及腎重指數(shù)減小，腎組織NO 含量增加，eNOS 蛋白表達(dá)減弱。說明纈沙坦及通心絡(luò)可調(diào)節(jié)DN 大鼠的腎功能，有效改善DN 大鼠早期腎小球高濾過狀態(tài)。其作用機(jī)制可能與通心絡(luò)抑制eNOS 蛋白表達(dá)，使NO的釋放減少，促使腎小球入球小動(dòng)脈舒張減弱，改善腎小球高濾過狀態(tài)有關(guān)。

3.4 展望

本實(shí)驗(yàn)初步探討了通絡(luò)干預(yù)療法對糖尿病腎病大鼠的治療作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通心絡(luò)可有效改善糖尿病腎病大鼠早期高濾過狀態(tài)，其作用機(jī)制可能與降低腎組織NO 含量及eNOS 蛋白表達(dá)量有關(guān)。其具體作用機(jī)制及對糖尿病腎病的遠(yuǎn)期療效有待進(jìn)一步研究。

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