新型殺蟲劑甲維鹽的快速定性鑒別方法

盧延旭 唐瑋瑋 許英健 朱曉凱 穆 彪

（中國刑警學院 遼寧 沈陽 110035）

新型殺蟲劑甲維鹽的快速定性鑒別方法

盧延旭 唐瑋瑋 許英健 朱曉凱 穆 彪

（中國刑警學院 遼寧 沈陽 110035）

建立了原藥和生物檢材中新型殺蟲劑甲維鹽的系列快速定性鑒別方法，包括理化性狀鑒別、顯色反應鑒別、紫外鑒別、薄層鑒別和液-質(zhì)（HPLC-MS）定性鑒別等方法，借助這些快速鑒別方法可與其他類殺蟲劑如有機磷酸酯類、氨基甲酸酯類和新型殺蟲劑阿維菌素，以及具有十四元環(huán)/十五元環(huán)的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素藥物紅霉素、羅紅霉素、阿奇霉素等相鑒別。

甲維鹽 十六元環(huán) 大環(huán)內(nèi)酯結(jié)構(gòu) 定性鑒別

甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽(Emamectin Benzoate，簡稱甲維鹽)，是繼有機磷酸酯類、氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯類和新煙堿類殺蟲劑之后的新一代具有十六元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的抗生素類殺蟲劑，現(xiàn)已廣泛應用于家庭殺蟲、殺螨和農(nóng)業(yè)上水稻、玉米、大豆、高粱、谷物、棉花、果樹、蔬菜等的廣譜殺蟲。近些年來，隨著甲維鹽等新型農(nóng)藥的推廣使用，因噴霧吸入，驅(qū)蟲使用過量、誤服、投毒、自殺等各類中毒事件時有發(fā)生。為了協(xié)助公、檢、法、司系統(tǒng)法醫(yī)和化驗室技術(shù)人員做好相關(guān)案件的法醫(yī)學檢驗和毒物分析工作，本文首次系統(tǒng)建立了原藥和生物檢材中新型殺蟲劑甲維鹽的快速定性鑒別方法。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗藥品與試劑

甲維鹽標準品（Emamectin Benzoate），白色粉末，純度99.99%；3.2%甲維鹽，3.2%阿維菌素，80%敵敵畏，90%滅多威（萬靈）；甲醇，色譜純99.9%；甲醇，分析純≥99.5%；丙酮，分析純≥99.5%；其余試劑和藥品均為市售分析純或色譜純。

1.2 實驗設(shè)備、儀器與材料

DDL-5型低速冷凍離心機、TGL-16G型高速冷凍離心機；LXQ10208型液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀。色譜條件：色譜柱 Thermo Gold ODS（150.0mm× 2.1mm，5μm）不銹鋼柱，內(nèi)填DurashellC18；柱溫35.0℃；流動相甲醇 5mmol乙酸胺 +0.2%冰乙酸+10%甲醇=80∶20（v／v）；流速0.2 mL/min；進樣量10μL。質(zhì)譜條件：電噴霧離子化源(ESI)，正離子方式檢測，全離子掃描模式；掃描范圍240.00～900.00amu；毛細管溫250℃，毛細管電壓42V；源電壓5.0kV；鞘氣(N2)30arb。MD 100-2型電子天平；DL-CJ-1F實驗醫(yī)用型潔凈工作臺；FSH-2可調(diào)高速分散勻漿機；JKDP型旋渦振蕩器；KQ-100DB型數(shù)控超聲波清洗器；微量移液器；微孔濾膜等。

1.3 實驗方法

1.3.1 理化性狀鑒別

取4個陶瓷皿，分別用乳膠頭滴管加入2%甲維鹽、2%阿維菌素、2%敵敵畏和2%萬靈4種農(nóng)藥各1ml，肉眼觀察顏色、氣味和pH值。用乳膠頭滴管依次向敵敵畏、萬靈、阿維菌素和甲維鹽等4種農(nóng)藥原藥或染毒小白鼠的胃內(nèi)容物凈化上清液中加入等量的36%鹽酸/98%硫酸并震蕩后，觀察上述4種農(nóng)藥的顏色變化。

1.3.2 顯色反應鑒別

將 2%甲維鹽原藥或含有甲維鹽 （＞20μg /mL）的胃內(nèi)容物凈化上清液2mL置于陶瓷皿中，滴加0.1%高錳酸鉀2～3滴，觀察高錳酸鉀溶液的褪色時間。將2%甲維鹽溶液（乳白色顆粒原藥用甲醇配制而成）或含有甲維鹽（＞20μg/mL）的胃內(nèi)容物凈化上清液2mL置于陶瓷皿中，加入0.1%高錳酸鉀溶液（粉紅色）2～3滴，振搖3～5分鐘后液體呈淺土黃色，再加入1%2,4-二硝基苯肼乙醇溶液（橘黃色）2～3滴，振搖3～5分鐘，觀察甲維鹽混合溶液的顏色變化。將含有甲維鹽（＞20μg/mL）的胃內(nèi)容物凈化上清液2mL或濃度在20～100μg/mL之間的甲維鹽標準品溶液2mL置于陶瓷皿中，加1%亞硝酸鈉3～5滴，再滴加濃鹽酸2～3滴，充分振搖后，觀察甲維鹽混合溶液的顏色變化。

1.3.3 紫外鑒別

用紫外分光光度計檢測甲維鹽和紅霉素甲醇溶液在243nm波長處的最大吸收峰。

1.3.4 薄層鑒別

將含有甲維鹽（＞20μg/mL）的胃內(nèi)容物凈化上清液或濃度在20～100μg/mL之間的甲維鹽溶液，點樣于硅膠G薄層板起點線上，采用展開系統(tǒng)A：三氯甲烷-甲醇-氨水（100:5:1）或展開系統(tǒng)B：乙酸乙酯-正己烷-氨（10:1.5:1.5）展開1h，在紫外燈（UV254nm）下甲維鹽顯示斑點；噴霧碘蒸氣，觀察和比較甲維鹽標準品和樣品的顯色情況和Rf值是否一致。

1.3.5 高效液相-質(zhì)譜色譜法（HPLC-MS）定性

精密稱取甲維鹽標準品10mg，置于100mL容量瓶中，標記后用甲醇稀釋至刻度，配制成100μg/mL母液，再從母液容量瓶中各吸取1mL，分別置于各自的10mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配制10μg/mL的甲維鹽標準工作液。分別采集甲維鹽中毒死家兔的心血lmL，分別用3mL水稀釋，渦旋混合1min，8000r／min離心10min，上清液過Oasis? HLB固相萃取柱，(預先以1mL甲醇，1mL水活化)，以1mL50%甲醇水溶液淋洗雜質(zhì)，棄去，吸取1.0mL甲醇液洗脫測定物，收集洗脫液，過0.2μm微孔濾膜，進樣10μL供HPLC／MS檢測用。分別采集甲維鹽中毒死家兔的心、肝、脾、肺、腎、腦、肌肉、胃組織1g，加丙酮∶水（3∶1）至10mL浸泡，經(jīng)組織勻漿機搗碎，超聲20min，8000r/min離心10min，取上清液，在50℃恒溫下氮氣流揮至2m，8000r/min離心10min，取上清液，過Oasis?HLB固相萃取柱（預先以1mL甲醇，1mL水活化），以1mL 50%甲醇水溶液淋洗雜質(zhì)，棄去，吸取1.0mL甲醇液洗脫測定物，收集洗脫液，過0.2μm微孔濾膜，進樣10μL供HPLC/MS檢驗用。

2 結(jié)果

2.1 甲維鹽原藥與其他類農(nóng)藥相比較的顏色、氣味和PH值

2%甲維鹽為淡黃色，有刺鼻的糖醋味，pH值為5；2%敵敵畏為土黃色，有刺鼻的氯醛味，pH值為2；2%萬靈為藍色，有魚腥味，pH值為8；2%阿維菌素呈綠褐色，有濃烈的糖醋味，pH值為6。

2.2 濃鹽酸/濃硫酸水解顯色反應

2%甲維鹽在濃鹽酸/濃硫酸作用下呈白色凝乳狀且液面漂浮黃色油珠或形成黃色環(huán)狀物。而2%敵敵畏、2%萬靈和2%阿維菌素在36%鹽酸/98%硫酸作用下分別呈現(xiàn)土黃色、黃綠色和咖啡色/土黃色、草綠色和紅棕色。

2.3 高錳酸鉀反應

甲維鹽為十六元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類殺蟲劑，其分子中含有共軛雙鍵結(jié)構(gòu)，能在30秒以內(nèi)使高錳酸鉀的紫色消褪；而紅霉素等大環(huán)內(nèi)酯類藥物因分子中沒有共軛雙鍵結(jié)構(gòu)，導致高錳酸鉀紫色消褪的時間超過30秒。

2.4 高錳酸鉀和2,4-二硝基苯肼反應

2%甲維鹽甲醇溶液（淡黃色），與高錳酸鉀和2,4-二硝基苯肼反應后變成橘黃色帶有沉淀物的溶液（1h后變成鮮黃色）。提示甲維鹽含有酚羥基，借助此反應可與同類殺蟲劑阿維菌素等相鑒別（圖1）。

圖1 高錳酸鉀和2,4-二硝基苯肼反應

2.5 亞硝酸鈉-濃鹽酸反應

借助此反應主要檢測甲維鹽分子中的仲胺基，阿維菌素無此反應。仲胺基N上的H，在酸性條件下，可與亞硝基的雙鍵加成變?yōu)镹-亞硝基胺呈黃色。甲維鹽標準品溶液，與亞硝酸鈉-濃鹽酸反應后，溶液呈鮮黃色（圖2）。

圖2 亞硝酸鈉-濃鹽酸反應

2.6 紫外分光光度法鑒別

甲維鹽的紫外最大吸收峰為243nm，而紅霉素在此處無紫外吸收峰。

2.7 薄層色譜法鑒別

甲維鹽為十六元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類，薄層展開后僅用紫外燈（254nm）即可顯出斑點，而紅霉素等大環(huán)內(nèi)酯類藥物在紫外燈下（254nm）沒有斑點。含有大環(huán)內(nèi)酯類基本母核的化合物遇碘顯示棕黃色。甲維鹽標準品溶液和含有甲維鹽的胃內(nèi)容物凈化上清液樣品，在薄層板上遇碘蒸氣顯示棕黃色斑點。采用三氯甲烷-甲醇-氨水（100:5:1）展開系統(tǒng)時，樣品的Rf值為0.53，與甲維鹽標準品的Rf值一致（圖3）。

圖3 甲維鹽的薄層色譜鑒別

2.8 高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC-MS）定性

在本色譜和質(zhì)譜條件下，甲維鹽的相對保留時間為7.12min。甲維鹽的[M+H]+準分子離子m/z886.56為母離子，主要碎片離子：m/z868.32，824.31，302.11，242.40。

3 討論

本文建立的甲維鹽系列定性鑒別方法主要包括理化性狀鑒別、4種顯色反應鑒別、薄層鑒別和高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC-MS）定性鑒別方法，填補了甲維鹽定性鑒別資料匱乏的空白。

甲維鹽屬于大環(huán)內(nèi)酯類殺蟲劑，加濃鹽酸或濃硫酸能使大環(huán)內(nèi)脂類水解呈色，借此能與其他類殺蟲劑如有機磷酸酯類、氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯類和新煙堿類殺蟲劑相鑒別。

根據(jù)高錳酸鉀褪色時間的長短，可以確定大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的母核結(jié)構(gòu)。甲維鹽的母核結(jié)構(gòu)為十六元環(huán)，有共軛雙鍵結(jié)構(gòu)，能在30秒以內(nèi)使高錳酸鉀褪色；而其他大環(huán)內(nèi)酯類藥物如具有十四元環(huán)母核的紅霉素、羅紅霉素、交沙霉素和克拉霉素，以及具有十五元環(huán)母核的阿奇霉素，均無共軛雙鍵結(jié)構(gòu)，高錳酸鉀褪色時間需要30秒以上。借此能將甲維鹽等十六元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類殺蟲劑與這些藥物加以區(qū)分。將浸有高錳酸鉀的試紙條陰干密封配備于法醫(yī)現(xiàn)場勘查箱中可以很便捷地進行現(xiàn)場快速篩查。

高錳酸鉀和2,4-二硝基苯肼反應，可用于鑒別酚羥基官能團，主要用于檢測甲維鹽分子中的酚羥基，借助此反應可以與同類殺蟲劑阿維菌素及其他不含酚羥基的殺蟲劑相鑒別。

亞硝酸鈉-濃鹽酸反應，主要檢測甲維鹽分子中的仲胺基。仲胺基N上的H，在酸性條件下，可與亞硝基的雙鍵加成變?yōu)镹-亞硝基胺呈黃色。阿維菌素無此反應，借此可與大環(huán)內(nèi)酯類殺蟲劑中的阿維菌素等同系物加以鑒別。

甲維鹽的紫外最大吸收峰為243nm，而紅霉素在此波長下無明顯的紫外吸收峰。薄層展開后，甲維鹽在紫外燈（UV254nm）下顯示斑點，而紅霉素沒有斑點。含有大環(huán)內(nèi)酯類基本母核的化合物遇碘顯示棕黃色。在薄層板上點樣后，采用三氯甲烷-甲醇-氨水（100:5:1）展開，含有甲維鹽和阿維菌素的樣品遇碘蒸氣均呈現(xiàn)棕黃色斑點，通過與甲維鹽和阿維菌素的標準對照品比對Rf值很容易鑒別。

采用液-質(zhì)聯(lián)用法，根據(jù)在相同色譜和質(zhì)譜條件下，甲維鹽的相對保留時間為7.12min和[M+H]+準分子離子m/z886.56為母離子，主要碎片離子：m/z868.32，824.31，302.11，242.40，可以很快確定樣品中或生物檢材中的甲維鹽成分。

以上定性方法互相補充，專屬性和特異性較好，非常適合現(xiàn)場快速檢驗和實驗室確證性鑒別。有關(guān)的現(xiàn)場快速篩查試劑盒正在組裝和試驗之中。

[1]中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會．中華人民共和國藥典2010版二部[M]．北京：化學工業(yè)出版社.

[2]王霞，丁曉萍．大環(huán)內(nèi)酯類藥物的分析[J]．實用醫(yī)技雜志，2006，5（12）.

[3]黃彬彬，駱桂紅，童小鈺等．復凝聚法制備甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽微囊[J]．農(nóng)藥學學報，2009，11（4）.

（責任編輯：于 萍）

R991

A

2013-12-1

公安部應用創(chuàng)新計劃項目（編號：2010YYCXXJXY112）。

盧延旭（1958-），男，遼寧沈陽人，中國刑警學院法醫(yī)學系教授，博士，主要從事法醫(yī)學研究。