蝮龍抗栓丸聯(lián)合骨髓干細(xì)胞移植對大鼠缺血再灌注腦損傷的作用

（沈陽市第二中醫(yī)醫(yī)院，遼寧 沈陽 110101）

蝮龍抗栓丸聯(lián)合骨髓干細(xì)胞移植對大鼠缺血再灌注腦損傷的作用

鄧秀君

（沈陽市第二中醫(yī)醫(yī)院，遼寧 沈陽 110101）

目的 本研究比較骨髓單個核細(xì)胞（BMSC）、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMNC）蛛網(wǎng)膜下腔移植以及中藥蝮龍抗栓丸聯(lián)合的方法治療缺血再灌注腦損傷（MCAO）大鼠。移植后 4、28 d 神經(jīng)功能損傷后的恢復(fù)情況。方法 將分離純化的 BMSC 和 BMNC 以蛛網(wǎng)膜下腔注射的方法移植到缺血再灌腦損傷大鼠顱內(nèi)，同時進(jìn)行中藥聯(lián)合治療。移植后 4、28 d 評定大鼠神經(jīng)功能損傷恢復(fù)情況。結(jié)果 與治療后第4 天相比，?？战M和各治療組在治療干預(yù)后第 28 天 MMNSS 神經(jīng)功能評分降低均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 以相同劑量的細(xì)胞進(jìn)行移植，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對神經(jīng)功能的修復(fù)作用更好，中藥聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對缺血性腦梗死神經(jīng)功能障礙的修復(fù)具有協(xié)同作用。

中藥；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；骨髓單個核細(xì)胞；大腦中動脈梗死；蛛網(wǎng)膜下腔；細(xì)胞移植；神經(jīng)功能評分

腦血管?。╟erebrovascular disease，CVD）以高發(fā)病率、高致殘率、高病死率成為嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病[1]。本研究分別應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC）和骨髓單個核細(xì)胞（bone marrow mononuclear cells，BMNC）于蛛網(wǎng)膜下腔移植以及中藥蝮龍抗栓丸聯(lián)合的方法治療缺血再灌注腦損傷（MCAO）大鼠。于移植后4、28 d應(yīng)用NSS神經(jīng)功能評價(jià)量表，評定MCAO大鼠的神經(jīng)功能損傷后的恢復(fù)情況。分析和評價(jià)了相同劑量、不同種類的同種異體骨髓源干細(xì)胞移植在促進(jìn)缺血性腦梗死大鼠神經(jīng)功能修復(fù)能力方面的差異，同時比較了單純骨髓干細(xì)胞移植和中藥與骨髓干細(xì)胞移植聯(lián)合治療方法之間的療效差異，篩選了更加適宜的中西醫(yī)聯(lián)合治療實(shí)驗(yàn)方案。進(jìn)而為探討骨髓源干細(xì)胞移植，以及中藥聯(lián)合骨髓源干細(xì)胞移植治療缺血性腦血管病的作用研究提供了可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)動物：Wistar大鼠SPF/VAF級雄性（北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司），共計(jì)150只。其中，3～4個月齡，（280±20）g，140只；3～4周齡，70～90 g，10只。主要試劑：培養(yǎng)基L-DMEM、胎牛血清、0.25%胰酶（均來自美國GIBCO公司）；5’-溴脫氧核苷尿嘧啶（武漢博士德公司）；大鼠淋巴細(xì)胞分離液（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所）；蝮龍抗栓丸（沈陽市蘇家屯區(qū)中醫(yī)醫(yī)院）主要成分為天麻、菖蒲、黃芪、丹參、川芎、蝮蛇等。

1.2 方法

1.2.1 動物的分組與干預(yù)方案：取3～4個月的Wistar雄性大鼠，140只，隨機(jī)分成7組，每組20只。分別為正常組、假手術(shù)組、?？战M、BMNC組、中藥聯(lián)合BMNC組、BMSC組、中藥聯(lián)合BMSC組。術(shù)后24 h進(jìn)行蛛網(wǎng)膜下腔細(xì)胞移植和中藥灌胃，直至4、28 d取材。

1.2.2 骨髓源干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)：取3～4周齡Wistar雄性大鼠，10%水合氯醛腹腔麻醉，無菌條件下取出股骨、脛骨。剪開股、脛骨兩端，用4 ℃PBS反復(fù)沖洗骨髓。離心，收集中間的單個核細(xì)胞層。用含10%胎牛血清L-DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱，飽和濕度條件下培養(yǎng)。24 h后更換新培養(yǎng)液，去除未貼壁細(xì)胞，以后每3天換液1次。顯微鏡下觀察細(xì)胞生長達(dá)到80%～90%時，用0.25%胰蛋白酶消化備用。

1.2.3 大鼠缺血再灌腦損傷模型建立：動物造模采用Zea Longa改良線栓法[1]，建立大鼠大腦中動脈栓塞2 h再灌注模型（middle cerebral arterial occlusion，MCAO）。選擇3～4個月齡雄性Wistar大鼠，腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛（300 mg/kg）麻醉后，仰臥固定。鈍性分離暴露右側(cè)頸總動脈（CCA），頸外動脈（ECA），頸內(nèi)動脈（ICA），結(jié)扎CCA，在根部結(jié)扎ECA，在CCA近頸內(nèi)、頸外分叉處剪一小口，將末端燒成圓頭的4 cm的尼龍線順勢緩慢送入ICA，深度約為（18±2）mm，結(jié)扎ICA，在MCA起始端堵塞MCA的血流。血流阻閉2 h后，抽出尼龍線，恢復(fù)灌注。麻醉蘇醒后，mNSS評分在6分以上的大鼠為造模成功。假手術(shù)組大鼠操作至暴露ICA、ECA后簡單剝離即縫合，其余處理同手術(shù)組。正常組不處理。

1.2.4 BMSC或BMNC的蛛網(wǎng)膜下腔移植：MCAO模型鼠造模24 h后，異丙酚尾靜脈麻醉，然后枕骨大孔處將BMSCs或BMNCs制成的細(xì)胞懸液，以1 μL/min進(jìn)行蛛網(wǎng)膜下腔注射，?？战M以0.01 MPBS代替。移植的細(xì)胞總數(shù)約為2×107個，體積為100 μL。注意速度要慢，以防MCAO動物顱內(nèi)壓過高，導(dǎo)致死亡。

1.2.5 大鼠神經(jīng)功能的評定：采用NSS綜合評價(jià)各組大鼠在腦缺血再灌注損傷后的神經(jīng)功能。主要觀察大鼠的運(yùn)動、感覺、平衡、神經(jīng)反射和總體表現(xiàn)，進(jìn)而系統(tǒng)評價(jià)神經(jīng)系統(tǒng)損傷的嚴(yán)重程度。分別于治療干預(yù)4、28 d對各實(shí)驗(yàn)組大鼠予以相應(yīng)的神經(jīng)功能評定。

2 結(jié) 果

實(shí)驗(yàn)大鼠于手術(shù)中呼吸、體溫維持在正常生理范圍，造模術(shù)后2～3 h大鼠可蘇醒，創(chuàng)口無活動性出血。140只實(shí)驗(yàn)大鼠，造模手術(shù)死亡9只，評分不符合標(biāo)準(zhǔn)剔除7只，灌胃死亡2只，足趾損傷3只（考慮造模導(dǎo)致患側(cè)足部感覺異常，大鼠自行咬傷，予以剔除），最終納入統(tǒng)計(jì)分析的標(biāo)本數(shù)共計(jì)114只，平均每組16只。MCAO造模后，大鼠反應(yīng)和精神狀態(tài)較差，多臥少動，毛色晦暗、蓬亂，體質(zhì)量逐漸下降，3～7 d后逐漸開始逐漸恢復(fù)。以?？战M表現(xiàn)較典型，細(xì)胞組及中藥聯(lián)合治療組大鼠一般狀態(tài)及體質(zhì)量恢復(fù)較快。

神經(jīng)功能評分（mMMNSS量表）結(jié)果：采用神經(jīng)功能損傷量表（mMMNSS）綜合評價(jià)各組大鼠在腦缺血再灌注損傷后的神經(jīng)功能。MCAO術(shù)后24 h評分在6分以上者可進(jìn)入本實(shí)驗(yàn)研究，其余剔除。治療干預(yù)4、28 d實(shí)驗(yàn)大鼠神經(jīng)功能評分見表1，各組4、28 d實(shí)驗(yàn)大鼠神經(jīng)功能評分對比見表1。

各組實(shí)驗(yàn)大鼠神經(jīng)功能評分結(jié)果說明，治療干預(yù)后第4天：與模型組比較，BMNC組和中藥聯(lián)合BMNC組MMNSS神經(jīng)功能評分變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），BMSC組和中藥聯(lián)合BMSC組MMNSS神經(jīng)功能評分降低具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與BMNC組比較，中藥聯(lián)合BMNC組MMNSS神經(jīng)功能評分變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），BMSC組和中藥聯(lián)合BMSC組MMNSS神經(jīng)功能評分降低具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與BMSC組比較，中藥聯(lián)合BMSC組MMNSS神經(jīng)功能評分降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與中藥聯(lián)合BMNC組比較，中藥聯(lián)合BMSC組MMNSS神經(jīng)功能評分降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 4、28 d各組大鼠神經(jīng)功能評分（xˉ±s）

治療干預(yù)后第28天：與模型組比較，BMNC組MMNSS神經(jīng)功能評分變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），中藥聯(lián)合BMNC組、BMSC組和中藥聯(lián)合BMSC組MMNSS神經(jīng)功能評分降低具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與BMNC組比較，中藥聯(lián)合BMNC組、BMSC組和中藥聯(lián)合BMSC組MMNSS神經(jīng)功能評分降低具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與BMSC組比較，中藥聯(lián)合BMSC組MMNSS神經(jīng)功能評分變化沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與中藥聯(lián)合BMNC組比較，中藥聯(lián)合BMSC組MMNSS神經(jīng)功能評分變化沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

與治療后第4天相比，?？战M和各治療組在治療干預(yù)后第28天MMNSS神經(jīng)功能評分降低均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討 論

3.1 骨髓源干細(xì)胞的移植時機(jī)和劑量

移植動物實(shí)驗(yàn)對最佳移植時間進(jìn)行了大量的研究，從腦梗后1、7、14、30 d等[2-5]均有相關(guān)的研究。并且移植后動物神經(jīng)功能都有一定程度的改善。動物實(shí)驗(yàn)關(guān)于BMSCs治療腦梗死細(xì)胞劑量研究較多。目前比較認(rèn)同的細(xì)胞劑量是1×106[6]。

3.2 中藥復(fù)方聯(lián)合骨髓干細(xì)胞移植對MCAO大鼠神經(jīng)功能修復(fù)的影響

缺血性腦梗死屬中醫(yī)“中風(fēng)”范疇，其病機(jī)復(fù)雜，以氣虛血瘀，風(fēng)火夾痰濁夾瘀，痹阻脈絡(luò)為主要病機(jī)。中藥復(fù)方蝮龍抗栓丸以“益氣活血、熄風(fēng)化痰、化瘀通絡(luò)“為治法，對缺血性中風(fēng)發(fā)揮治療作用[7]。諸藥協(xié)同發(fā)揮改善腦內(nèi)血液循環(huán)，調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能，調(diào)節(jié)免疫和炎癥等作用。動物實(shí)驗(yàn)和臨床觀察表明，蝮龍抗栓丸治療腦梗死的效果肯定[7]，可顯著改善患者的生存質(zhì)量。

中藥對BMSC的影響可以概括為促進(jìn)BMSCs的生長、增殖、分化，改變其分泌狀態(tài)以及保護(hù)分化后的神經(jīng)細(xì)胞等多個環(huán)節(jié)[8]。近年來漸有中醫(yī)藥在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療腦缺血損傷影響方面的報(bào)道，但研究多集中于對其體外的誘導(dǎo)分化方面，所選藥物以單味中藥或提取物為主，而中藥復(fù)方對BMSC移植后體內(nèi)細(xì)胞因子代謝方面的研究少見。中藥對移植后微環(huán)境的調(diào)控對MSCS存活、遷移、分化[9]，以及恢復(fù)神經(jīng)組織的結(jié)構(gòu)和功能具有重要意義。BMSCS屬于移植物，其移植后能否很好地存活、整合于病變部位，與其他神經(jīng)元建立神經(jīng)通路是移植細(xì)胞修復(fù)神經(jīng)功能的基礎(chǔ)[10]。BMSCs移植后腦內(nèi)微環(huán)境在其存活、遷移和分化中具有重要作用。移植后腦內(nèi)微環(huán)境主要由神經(jīng)營養(yǎng)因子、炎性因子等構(gòu)成，中藥調(diào)控神經(jīng)營養(yǎng)因子、炎性因子等微環(huán)境變化對BMSC移植治療腦缺血損傷具有重要意義[11]。

本研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注可引起大鼠急性神經(jīng)功能損傷，早期損害較嚴(yán)重，隨著時間推移大鼠對神經(jīng)損傷自愈有能力，28 d時損傷的神經(jīng)功能較急性期已有明顯恢復(fù)，僅存留輕度神經(jīng)功能障礙。說明MCAO大鼠對神經(jīng)損傷具有自愈能力。與模型組相比，BMSC組、中藥聯(lián)合BMSC組于移植早期（4 d）和后期（28 d）能夠明顯改善MCAO大鼠神經(jīng)功能評，且早期以中藥聯(lián)合治療效果更顯著，提示中藥聯(lián)合應(yīng)用可以協(xié)同提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對腦缺血性梗死治療的早期效果。而骨髓單個核細(xì)胞對MCAO大鼠神經(jīng)功能障礙修復(fù)功能在早期和后期始終未能體現(xiàn)出優(yōu)于自然恢復(fù)的治療效果。中藥聯(lián)合骨髓單個核細(xì)胞治療在早期亦未見療效，于移植后28 d方顯示出神經(jīng)功能改善作用。接受移植的MCAO大鼠覓食、行為活動等習(xí)性未見異常改變，無脫毛、發(fā)熱、腹瀉、出血及免疫排斥現(xiàn)象。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果提示：①同種異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對成年大鼠未產(chǎn)生不良反應(yīng)；②以相同劑量的和骨髓單個核細(xì)胞進(jìn)行移植，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對神經(jīng)功能的修復(fù)作用更好；③中藥的聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對缺血性腦梗死神經(jīng)功能障礙的修復(fù)具有協(xié)同作用。

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R285.5；R743.3

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：1671-8194（2014）30-0067-02