SELEX技術(shù)篩選甲基苯丙胺適配子

陸鑫蔚，胡小龍，張玉榮，孫美琪，曹芳琦，黃琴蓉，曾立波

（1.中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院上海醫(yī)藥工業(yè)研究院 創(chuàng)新藥物與制藥工藝國家重點實驗室，上海200437；2.上海市公安局物證鑒定中心 上海市現(xiàn)場物證重點實驗室，上海200083）

甲基苯丙胺（methamphetamine）俗稱冰毒，是一種依賴性極高的精神活性物質(zhì)，是國家嚴控的一類精神藥品和麻醉藥品（國食藥監(jiān)安2005年481號文件）。目前，國際上苯丙胺類物質(zhì)的濫用呈不斷上升趨勢。專家們預(yù)測，苯丙胺類興奮劑將成為21世紀最廣泛濫用的藥物[1]。由于現(xiàn)在研發(fā)的甲基苯丙胺膠體金標單抗試劑盒都會有不同程度的交叉反應(yīng)，所以本課題旨在研究針對甲基苯丙胺特異性結(jié)合的適配子，為研發(fā)高度特異性甲基苯丙胺適配子試劑盒奠定基礎(chǔ)。

核酸適配子（Aptamer）是體外化學(xué)合成并能與靶分子特異性結(jié)合的單鏈DNA或RNA寡核苷酸分子。針對結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)，適配子的特異性及親和性都優(yōu)于抗體。SELEX（配體指數(shù)增強系統(tǒng)進化技術(shù)）是Tuerk和Gold[2]在1990年分別研究的一種新的組合化學(xué)技術(shù)，其應(yīng)用大容量的隨機寡核苷酸文庫，并結(jié)合體外PCR擴增技術(shù)，以指數(shù)級富集與靶分子特異結(jié)合的寡核苷酸，經(jīng)過多輪篩選，獲得高親和力、特異性強的寡核苷酸適配子[3]。目前，該技術(shù)已被成功地用于篩選各種靶物質(zhì)的結(jié)合序列，包括小分子[4]、蛋白質(zhì)[5]、無機物[6]等等。篩選到的小分子物質(zhì)的適配子包括藥物（可卡因[7]）、毒物（蛤蚌毒素[8]）、農(nóng)藥（毒死蟬[9]）等的適配子。小分子毒品毒物的適配子篩選難度較大，目前報道較少，所以本研究旨在運用SELEX技術(shù)從合成的隨機單鏈DNA（ssDNA）文庫中篩選到針對甲基苯丙胺的特異性適配子，為小分子毒品毒物適配子的篩選提供一個技術(shù)平臺。

1 材料和方法

1.1 材料

體外設(shè)計和合成76 bp的隨機ssDNA文庫：5’-GCG GAT GAA GAC TGG TCT-N40-GCC CTA AAT ACG AGC AAC-3’，上游引物 F：5’-FAM-GCGGATGAAGACTGGTCT-3’，下游引物 R：5’-Biotin-GTTGC TCGTATTTAGGGC-3’。文庫和引物合成（上海英駿生物技術(shù)有限公司）。試劑中所用膠純化試劑盒、鏈霉親和素磁珠、溴化氰活化瓊脂糖、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、N-乙基-N-（二甲氨基丙基）碳二亞胺（EDC）都購于Sigma公司；2×PCR mix（天根生物有限公司）；甲基苯丙胺完全抗原（杭州隆基生物技術(shù)有限公司）；DNA序列測定（上海英駿生物技術(shù)有限公司）。

1.2 儀器

Veriti PCR儀（美國AB公司）；全自動凝膠成像分析儀（英國Syngene公司）；Tanon電泳儀（廣州譽維生物科技儀器有限公司）；振蕩培養(yǎng)箱（SHEL LAB）、BI-3000。型表面等離子體共振儀（Biosensing Instrument Inc）。

1.3 方法

1.3.1 甲基苯丙胺完全抗原與溴化氰活化瓊脂糖偶聯(lián)

稱2 g溴化氰活化瓊脂糖，活化后與5 mg甲基苯丙胺完全抗原孵育過夜，用0.1M NaHCO3（含0.5 M NaCl）洗滌，離心半徑 13.5 cm，3 000 r/min 離心 5 min，棄上清。用0.2M甘氨酸進行封閉過夜。封閉后用結(jié)合緩沖液（20mmol/LTris-HCl，137mmol/L NaCl，5mmol/L KCl，2mmol/L CaCl2， 1mol/L MgCl2）洗滌，洗滌完裝入親和層析柱中。按如上方法制備含BSA的親和層析柱作為陰性柱。

1.3.2 SELEX篩選

（1）結(jié)合：將200 pmol/L的ssDNA庫95℃熱變性10 min，迅速冷卻到0℃，5 min之后將ssDNA文庫先加入陰性柱進行反篩選，收集液體再加入含甲基苯丙胺的柱子，用Binding Buffer洗3次。

（2）洗脫：加入 100 μg/mL 甲基苯丙胺進行洗脫，收集洗脫液進行PCR。

（3）PCR反應(yīng)：PCR反應(yīng)體系：ssDNA模板23 μL，上游引物1μL，下游引物1μL，2×PCR緩沖液25 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3min，25個循環(huán)的95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，最后72℃延伸3 min。

（4）純化：將PCR產(chǎn)物走2%的瓊脂糖凝膠，把想要的膠切下并純化。

（5）ssDNA次級庫的合成：將純化后的帶生物素的dsDNA與鏈霉親和素磁珠在1×B&W緩沖液（pH7.5，10mM Tris-HCL，1mM EDTA，2M NaCl） 室溫條件下結(jié)合30min左右。用1×B&W緩沖液洗滌2～3次，加入 150 mM NaOH 37℃孵育 15 min，使 dsDNA解鏈，用磁力架分離，使含生物素的一條ssDNA留在鏈霉親和素磁珠上，而另一條不帶生物素的ssDNA用于下一輪篩選的次級文庫。

（6）重復(fù)以上步驟10輪。

1.3.3 SPR檢測結(jié)合率

（1）CM5傳感片的包被：2 mM巰基乙胺1 mL滴在金膜上孵育12 h，再將15 mM NHS和75 mM EDC（新鮮配制）與6 mg/mL CM-dextran進行混合并滴在金膜表面3 h。

（2）結(jié)合率的測定：流速控制在 40 μL/min，先通過一段連續(xù)的結(jié)合緩沖液沖洗直至基線穩(wěn)定。當(dāng)基線穩(wěn)定后，注射含0.4M EDC和0.1M NHS的氨基偶聯(lián)試劑200μL，活化CM5傳感片上的羧基。將甲基苯丙胺完全抗原用結(jié)合緩沖液稀釋至5mg/mL，注射該溶液200μL，由于甲基苯丙胺完全抗原上BSA的氨基與傳感片上活化的酯基發(fā)生氨基偶聯(lián)反應(yīng)而使甲基苯丙胺被固定在傳感片上。注射200μL的1M乙醇胺溶液，用來封閉金膜上尚未發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)的酯基。最后注入200μL的結(jié)合緩沖液除去非特異吸附的乙醇胺。將第1輪到第10輪的ssDNA分別注入SPR儀中，與金膜表面上的甲基苯丙胺作用一段時間，用20mM的NaOH再生液使基線恢復(fù)，實時采集響應(yīng)信號。重復(fù)以上相同步驟來檢測BSA（陰性對照）是否結(jié)合適配子。

1.3.4 克隆和測序

最后一輪篩選的產(chǎn)物經(jīng)PCR擴增純化后，連接到pUC-T載體上，在轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞DH5α中，通過培養(yǎng)、藍白斑篩選，挑出10個白色菌落，搖菌，對菌液提取質(zhì)粒進行電泳驗證，挑出10個陽性克隆進行序列測定（上海英駿生物技術(shù)有限公司測定）。

1.3.5 適配子結(jié)構(gòu)預(yù)測與分析

將測序獲得的適配子序列用Clustal X和MFOLD[10]軟件分析適配子一級結(jié)構(gòu)的同源性，并進行二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測。

2 結(jié)果

2.1 PCR條件優(yōu)化結(jié)果

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同的退火溫度、循環(huán)次數(shù)、模板量均會影響ssDNA擴增為dsDNA的PCR擴增效果，在每一輪篩選的PCR過程中，都應(yīng)該經(jīng)過2%的瓊脂糖凝膠電泳確定目的條帶最亮，無非特異性擴增的最佳PCR條件后，再大量擴增用于下一輪的篩選。將退火溫度分別設(shè)為 53℃，55℃，57℃，59℃，61℃時，由圖1可見，退火溫度為55℃時條帶最清晰、明亮，且非特異性少，所以選擇55℃為最優(yōu)退火溫度。將每輪PCR產(chǎn)物進行2%的瓊脂糖凝膠電泳顯示（見圖2），在100bp以下均出現(xiàn)預(yù)期的單一條帶（理論為76bp），條帶隨著輪數(shù)的增加而越來越致密且單一。

圖2 第1～10輪PCR產(chǎn)物的2%瓊脂糖凝膠電泳圖譜

2.2 SPR檢測結(jié)合率的結(jié)果

用SPR檢測每輪ssDNA文庫與甲基苯丙胺完全抗原的親和力，陰性對照使用BSA檢測每輪ssDNA文庫，圖3可見，RU值從第1輪的88.3上升到第8輪的110.9，呈上升趨勢。自第8輪之后的兩輪的RU值無明顯變化，說明適配子與甲基苯丙胺完全抗原的結(jié)合親和力達到飽和。BSA的陰性對照顯示每輪ssDNA文庫與BSA完全沒有響應(yīng)，說明我們篩選出的適配子只和甲基苯丙胺結(jié)合，不和BSA結(jié)合。

圖3 SPR測定每輪ssDNA和甲基苯丙胺完全抗原的結(jié)合率

2.3 甲基苯丙胺完全抗原適配子的測序結(jié)果和二級結(jié)構(gòu)的分析

經(jīng)分析，有10個克隆子測序成功。如表1所示，A05、B09-891、E06-924 和 H11 的序列是一致的，B03和F07-937的序列是一致的，G06和G11的序列是一致的。

表1 適配子測序結(jié)果

圖4 甲基苯丙胺適配體二級結(jié)構(gòu)

通過軟件預(yù)測了5個有活性的適配子的二級結(jié)構(gòu)（見圖4），發(fā)現(xiàn)這些預(yù)測的結(jié)構(gòu)圖都含有莖-環(huán)結(jié)構(gòu)?？煞譃閮深悾旱谝活悶锳05，B03和E08，主要是5’端和3’端的固定序列形成了一個大的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，中間隨機序列形成了莖-環(huán)結(jié)構(gòu)；第二類為E01和G06，主要是5’端和3’端的固定序列分別和隨機序列形成了莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。

3 討論

適配子是通過SELEX技術(shù)篩選出來的一段寡核苷酸序列。它的穩(wěn)定性、親和力和特異性都優(yōu)于抗體；制備適配子可以通過體外篩選，無需免疫動物；變性與復(fù)性可逆；無批間差異；可修飾并易于長期保存和室溫運輸?shù)?。一般用于SELEX技術(shù)篩選的寡核苷酸鏈文庫有3種：隨機RNA文庫、經(jīng)修飾的RNA文庫和ssDNA文庫。本研究采用的ssDNA文庫全長76 bp，中間為40 bp的隨機核苷酸序列，由A、G、C、T密碼子隨機組合，這樣可能有440個理論組合，即理論庫容量為1015，足以滿足篩選適配子的需求。大分子物質(zhì)如蛋白、細胞等適配子的篩選采用離心、沉淀的方法就可以篩選得到，而小分子物質(zhì)首先必須將其固定或包被在固相載體上，制成親和介質(zhì)后方可進行SELEX篩選。本研究采用小分子的完全抗原進行篩選，利用BSA將小分子固定在親和層析柱上，克服了小分子難以固定在固相介質(zhì)的難題，為了去除與固相介質(zhì)結(jié)合和BSA的非特異性反應(yīng)，我們在每2輪篩選后進行一次反篩選，即用次級文庫先與偶聯(lián)BSA的親和層析柱結(jié)合反應(yīng)一定時間后，再與偶聯(lián)甲基苯丙胺完全抗原的親和層析柱進行篩選，反篩對于從復(fù)雜的核酸序列中篩選針對靶分子的特異的適配子價值較大，即降低了篩選背景，又增加SELEX篩選的嚴謹性，所以進行反篩選是必不可少的。

SELEX篩選第一輪使用的文庫為合成的隨機寡核苷酸文庫，次級文庫主要來源于：（1）生物素-鏈霉親和素磁珠分離法；（2）不對稱PCR法。有報道稱，隨著篩選輪數(shù)增加，不對稱PCR得到的產(chǎn)物非特異性明顯增加，該法得到的ssDNA文庫不夠穩(wěn)定[11]。所以，我們采用了生物素-鏈霉親和素磁珠分離法制備次級文庫。

經(jīng)過10輪的篩選，瓊脂糖凝膠電泳驗證發(fā)現(xiàn)，隨著輪數(shù)的增加，條帶越來越清晰明亮，說明適配子的特異性也在逐步提高。通過用SPR測定每輪ssDNA文庫和甲基苯丙胺完全抗原的結(jié)合率結(jié)果顯示，結(jié)合率從88．3 RU上升到113．7 RU；說明得到了與甲基苯丙胺特異結(jié)合的適配子。獲得的適配子進行測序，得10個序列，二級結(jié)構(gòu)均為莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，可能是適配子和甲基苯丙胺結(jié)合的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

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