辛通暢絡法對系膜增生性腎炎模型大鼠IL-1、IL-6和細胞外基質(zhì)的影響

支勇 竇一田 曹式麗

（天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，天津 300193）

辛通暢絡法對系膜增生性腎炎模型大鼠IL-1、IL-6和細胞外基質(zhì)的影響

支勇 竇一田 曹式麗

（天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，天津 300193）

目的：觀察辛通暢絡中藥復方腎蘇Ⅱ?qū)ο的ぴ錾阅I炎（MsPGN）模型大鼠腎組織白介素1（IL-1）、白介素6（IL-6）及腎小球細胞外基質(zhì)（ECM）的影響，探討中醫(yī)藥防治MsPGN的有效途徑。方法：采用抗Thy-1系膜增生性腎炎大鼠模型，以中藥復方腎蘇Ⅱ為治療藥物，貝那普利為對照藥物，于治療6周末，分別觀察各組大鼠腎組織IL-1、IL-6和腎小球纖維連接蛋白（FN）、層粘連蛋白（LN）和Ⅳ型膠原（ColⅣ）表達的變化情況。結(jié)果：治療6周末，中藥組在抑制MsPGN大鼠腎組織IL-1、IL-6表達，減少腎小球FN、LN、ColⅣ表達量等方面顯示療效優(yōu)勢，且均明顯優(yōu)于西藥組。結(jié)論：以辛通暢絡立法的中藥復方腎蘇Ⅱ，具有減輕MsPGN模型大鼠腎小球ECM積聚，改善腎小球硬化的作用。

系膜增生性腎炎 辛通暢絡 中藥復方 白介素 腎小球細胞外基質(zhì) 實驗研究

系膜增生性腎小球腎炎（MsPGN）是臨床常見的腎小球疾病的病理類型，在我國原發(fā)性腎病綜合征中MsPGN高達30%[1]，成為導致腎小球硬化進而發(fā)展為晚期腎功能衰竭的主要疾病。MsPGN的組織學特征為腎小球系膜細胞的異常增生和系膜基質(zhì)的病理性積聚。在MsPGN的病變過程中，細胞因子起到重要作用，如IL-1、IL-6等。本研究采用抗大鼠胸腺細胞抗體（Anti-Thy-1）誘發(fā)MsPGN大鼠模型，觀察腎蘇Ⅱ?qū)δI組織IL-1、IL-6和腎小球基質(zhì)成分FN、LN和ColⅣ表達的影響。

1 實驗材料

1.1 實驗動物健康雄性日本大耳白兔4只，體重（1250± 250）g，普通級；遠交系健康雄性SD大鼠40只[10周齡，體重（150±10）g]，幼齡SD大鼠10只（4周齡），SPF/VAF級。以上實驗動物均由中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所動物中心提供（合格證號：SCXK津2005-0001）。

1.2 實驗試劑完全福氏佐劑與不完全福氏佐劑（Sigma公司）；IL-1、IL-6試劑盒（尚柏生物醫(yī)學技術(shù)北京公司）；FN、LN、ColⅣ試劑盒（Labvision公司）。

1.3 實驗藥物腎蘇Ⅱ，處方：柴胡12g，黃芩10g，生黃芪30g，當歸10g，女貞子15g，澤蘭15g，水蛭10g，細辛3g，煎煮濃縮（含0.85g生藥/mL），裝瓶密封，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｋ幬镔徸蕴旖蛑嗅t(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中藥房，加工由天津中醫(yī)藥大學藥廠協(xié)助完成。苯那普利：瑞士諾華制藥有限公司產(chǎn)品，規(guī)格：10mg/片，批號：06031404。

2 實驗方法

2.1 動物分組40只大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，按體重分層隨機分為正常組、模型組、西藥組和中藥組，每組10只。

2.2 模型復制參考文獻[2-4]復制抗Thy-1系膜增生性腎炎大鼠模型。大鼠30只，經(jīng)尾靜脈注射兔抗鼠胸腺細胞抗體血清（ATS），每周1次，連續(xù)3周，初次注射ATS（1∶32）1.0mL/只，加強注射ATS（1∶16）1.0mL/只。

2.3 給藥方法自MsPGN模型制備第1天起，中藥組每日1次以3.5g/100g體重灌服腎蘇Ⅱ，西藥組每日1次以0.33mg/100g體重灌服貝那普利混懸液，正常組與模型組每日1次灌服等量生理鹽水，共進行6周。實驗全程各組均給予普通飼料喂養(yǎng)，自由進水。實驗過程中因灌胃誤入氣管，中藥組于治療第4周初死亡1只，其他各組實驗過程中無動物死亡。

2.4 標本采集于給藥后第6周末殺檢全部大鼠，打開腹腔，摘取腎臟，迅速剪取部分腎組織放入凍存管并置于液氮中凍存，用于腎組織IL-1、IL-6檢測；另再取部分腎臟組織置于10%福爾馬林中固定，用于腎小球FN、LN、ColⅣ檢測。

2.5 檢測指標采用雙抗體夾心ELISA法檢測腎組織IL-1、IL-6。采用免疫組化ABC法檢測腎小球FN、LN、ColⅣ。采用HMIAS-2000高清晰度彩色病理圖像分析系統(tǒng)，于400倍高倍鏡下，每個標本隨機選取10個視域，測量腎小球FN、LN、ColⅣ表達的陽性反應物信號的面積比（陽性信號物質(zhì)占腎小球體的面積百分比），分析各組大鼠腎小球FN、LN、ColⅣ表達的相對水平，評價各組腎小球ECM增殖程度。

2.6 統(tǒng)計學方法實驗數(shù)據(jù)應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析，各組實驗數(shù)據(jù)以（±s）表示，對實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，檢驗結(jié)果以P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 各組大鼠腎組織IL-1、IL-6的表達實驗結(jié)果顯示，給藥6周末，模型組、西藥組、中藥組大鼠腎組織IL-1、IL-6表達均較正常組明顯增加（P＜0.01，P＜0.05）；西藥組、中藥組明顯低于模型組（P＜0.05，P＜0.01）；中藥組明顯低于西藥組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠給藥6周后腎組織IL-1、IL-6的表達（±s）pg/mL

表1 各組大鼠給藥6周后腎組織IL-1、IL-6的表達（±s）pg/mL

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與西藥組比較，△P＜0.05。

組別動物數(shù)IL-1IL-6正常組1068.76±43.11270.00±118.64模型組10西藥組10213.21±180.76**#499.90±245.99**#中藥組9171.58±113.34*##△325.46±193.05*##△291.21±189.23**523.71±167.73**

3.2 各組大鼠腎小球FN、LN、ColⅣ的表達量比較實驗結(jié)果顯示，給藥6周末，模型組、西藥組、中藥組大鼠腎小球FN、LN、ColⅣ的表達量較正常組不同程度增加（P＜0.05，P＜0.01）；其中模型組的表達量最高，中藥組明顯低于模型組（P＜0.01）與西藥組（P＜0.05，P＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠給藥6周后腎小球FN、LN、ColⅣ的表達量比較（±s）%

表2 各組大鼠給藥6周后腎小球FN、LN、ColⅣ的表達量比較（±s）%

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與西藥組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別動物數(shù)FNLN ColIV正常組100.37±0.140.72±0.221.18±0.12模型組10西藥組102.60±0.42**##中藥組91.48±0.12*##△△4.84±0.33**7.92±0.89**2.17±0.42**##5.47±0.68*#1.06±0.35*##△△1.89±0.55**##△6.56±1.50**

4 討論

MsPGN以腎小球系膜細胞（MsC）的異常增生和細胞外基質(zhì)（ECM）的病理性積聚為特征。腎小球系膜細胞是系膜區(qū)分泌合成ECM的主要細胞，ECM的過度生成和積聚是MsPGN病變的關(guān)鍵機制。本實驗中MsPGN模型組大鼠腎小球FN、LN、ColⅣ等ECM成分的表達量顯著增加，表明腎小球ECM的大量合成與積聚是導致MsPGN，并發(fā)展形成腎小球硬化的重要環(huán)節(jié)。針對此環(huán)節(jié)，通過抑制系膜細胞的異常增生，進而減少ECM的大量合成，應該是防治MsPGN的有效手段。

IL-1、IL-6是MsPGN中參與免疫調(diào)節(jié)和介導炎癥反應的細胞因子，同時也是重要的系膜細胞增殖促進因子。IL-1對系膜細胞的增殖和產(chǎn)生ECM具有促進作用，而且系膜細胞本身也可通過自分泌方式產(chǎn)生具有生物活性的IL-1并表達其受體。Werber等[5]研究發(fā)現(xiàn)在免疫復合物性腎炎大鼠腎小球系膜細胞的IL-1mRNA表達量比正常大鼠增加2～3倍，表明免疫復合物性腎炎大鼠腎小球系膜細胞能夠持續(xù)分泌大量的IL-1，刺激系膜細胞增殖及大量合成ECM。IL-6是促進系膜細胞增殖和產(chǎn)生ECM的另一重要細胞因子，也是系膜細胞自分泌的調(diào)節(jié)因子。正常腎臟能產(chǎn)生微量的IL-6并表達IL-6受體，而當腎小球系膜細胞受到病理因素的刺激后分泌IL-6異常增多，與受體結(jié)合刺激系膜細胞增殖，促進ECM的大量合成與積聚。如Horii等[6]研究顯示MsPGN的系膜細胞能分泌IL-6，并被IL-6所作用而進一步增殖。由于IL-1、IL-6是具有促進系膜細胞增殖作用的細胞因子，因此通過抑制IL-1、IL-6的表達來阻抑系膜細胞增殖及ECM的合成可成為防治MsPGN的有效途徑[5，7]。

中醫(yī)學認為絡脈是氣血運行通道，亦是病邪傳變途徑，具有易瘀易滯、易積成形的病理特點。腎為藏精貯液之臟，又為利水排毒之官，腎臟絡脈暢通、氣血充盈是其生理功能的前提，而腎氣虛弱作為慢性腎臟病的內(nèi)在病理基礎(chǔ)，與瘀血、濕濁、熱毒、外邪等病理因素相互影響，久病入絡，致腎之精血虛損，腎絡郁滯，故腎絡樞機不利，因虛致實，腎絡郁滯是MsPGN等多種慢性腎臟病的共同病理基礎(chǔ)。腎蘇Ⅱ是以“樞機不利，腎絡郁滯，虛實錯雜”為MsPGN病機關(guān)鍵，形成以“標本兼治、辛通腎絡”為法的中藥復方制劑。方中柴胡、黃芩暢達三焦，樞轉(zhuǎn)氣機；黃芪、當歸益氣補血，扶正理虛；細辛、水蛭辛通暢絡，化瘀消滯。諸藥協(xié)同，疏導調(diào)節(jié)，養(yǎng)臟和絡，促進腎絡氣血調(diào)暢。應用本方干預MsPGN大鼠模型，結(jié)果顯示腎蘇Ⅱ能夠顯著降低MsPGN大鼠腎組織IL-1、IL-6的表達量，同時減少腎小球FN、LN、ColⅣ等ECM成分的合成，減輕腎小球系膜基質(zhì)增生。通過上述IL-1、IL-6的促系膜細胞增殖及ECM增生的作用機制，我們推斷腎蘇Ⅱ防治MsPGN的機理可能是通過抑制MsPGN大鼠腎組織IL-1、IL-6的生成，減輕其對系膜細胞增殖的病理性作用，進而減少系膜細胞合成FN、LN、ColⅣ等ECM成分，達到阻抑腎小球系膜增生，防治腎小球硬化的效果。

[1]葉任高，主編.中西醫(yī)結(jié)合腎臟病學.北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：229

[2]Nomura K，Liu N，Nagai K，et al.Roles of coagulation pathway and factor Xa in rat mesangioproliferative glomerulonephritis.Lab Invest，2007，87（2）：150

[3]劉靜芳，溫進坤，嚴霞，等.抗胸腺細胞血清法誘發(fā)大鼠系膜增殖性腎炎模型.中國病理生理雜志，1999，15（3）：274

[4]Shinosaki T，Notoya M，Nomura Y，et al.Glomerular epithelial cell injury accelerates the progression of antibody -induced mesangial proliferative nephritis.Exp Nephrol，2002，10（4）：245

[5]Werber HI，Emancipator SN，Tykocinski ML，et al.The interleukin 1 gene is expressed by rat glomerular mesangial cells and is augmented in immune complex glomerulonephritis.J Immunol，1987，138（10）：3207

[6]Horii Y，Muraguchi A，Iwano M，et al.Involvement of IL -6 in mesangial proliferative glomerulonephritis.J Immunol，1989，143 （12）：3949

[7]Shima Y，Iwano M，Yoshizaki K，et al.All -trans -retinoic acid inhibits the development of mesangial proliferative glomerulonephritis in interleukin -6 transgenic mice.Nephron Exp Nephrol，2005，100（1）：54

R692.310.5

A

1672-397X（2014）01-0075-02

支勇（1974-），男，醫(yī)學博士，主治醫(yī)師，從事中西醫(yī)結(jié)合治療腎臟疾病的臨床與基礎(chǔ)研究。

曹式麗，shilicao@126.com

2013-09-26

編輯：吳寧

國家自然科學基金項目（30772808）